邵毅英，范玉琪，李思葳，趙冰冰，邵小婷，扈 敬，徐長(zhǎng)慶，魏 璨

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，哈爾濱 150086)

糖尿病(diabetesmellitus，DM)是胰島素分泌減少或胰島素抵抗而引起以血糖升高為主要特征的代謝性疾病，也是全球日益嚴(yán)峻的公共健康挑戰(zhàn)[1,2]。文獻(xiàn)報(bào)道，全球估計(jì)約有3.82億人患有糖尿病，到2040年該數(shù)字將達(dá)到6.42億[3]。糖尿病對(duì)機(jī)體的危害主要源于其并發(fā)癥的發(fā)生，例如，糖尿病性腎病引起腎功能不全，糖尿病性心肌病引起的心功能障礙，糖尿病性視網(wǎng)膜病變導(dǎo)致的視力下降甚至失明等[2]。肝臟是糖代謝的主要場(chǎng)所，也是胰島素的主要靶器官。學(xué)術(shù)界關(guān)注糖尿病和肝臟疾病之間的聯(lián)系，已有較長(zhǎng)時(shí)間。人們觀察到糖尿病患者常發(fā)生一系列肝臟病變，包括肝酶異常、非酒精性脂肪性肝病、肝硬化、肝細(xì)胞癌和急性肝衰竭[4]。因此，進(jìn)一步探究糖尿病性肝病的發(fā)生機(jī)制，并尋求有效的防治手段成為我們的關(guān)注點(diǎn)。

糖尿病性肝病的確切機(jī)制不詳，主要與糖代謝紊亂、胰島素抵抗、炎癥等引起肝臟結(jié)構(gòu)損傷，影響肝臟功能有關(guān)。因此，需要從新的視角進(jìn)行發(fā)病機(jī)制的探討。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)是 G 蛋白耦聯(lián)受體C家族成員，體內(nèi)分布廣泛，主要參與調(diào)控Ca2+穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、激素分泌和離子通道開啟等[5]。文獻(xiàn)報(bào)道，腎衰時(shí)血管鈣化伴血管平滑肌細(xì)胞 CaSR 功能性丟失[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：CaSR參與糖尿病心肌病的發(fā)生；CaSR在大鼠肝細(xì)胞有功能性表達(dá)，通過Gq-PLC-IP3通路可誘導(dǎo)BRL細(xì)胞發(fā)生缺血/再灌注損傷和細(xì)胞凋亡[7-9]。迄今為止，CaSR在糖尿病肝臟的表達(dá)變化及其作用，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

本文復(fù)制了1型糖尿病大鼠模型和高糖處理的星形細(xì)胞損傷模型，觀察CaSR是否參與糖尿病性肝損傷，并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠(200～250 g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，飼養(yǎng)條件為22～24℃、12 h晝夜規(guī)律，自由飲水進(jìn)食，隨機(jī)分成四組(每組n=10)：正常對(duì)照組(Control)，糖尿病2周模型組(2W)，4周模型組(4W)，8周模型組(8W)。本實(shí)驗(yàn)采用60 mg/kg STZ(溶于0.1 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)一次性腹腔注射，復(fù)制1型糖尿病模型；對(duì)照組注射相同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；糖尿病組注射STZ前禁食12 h；隨后立即喂24 h 10% 蔗糖水。注射 STZ一周后，大鼠尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖濃度(fasting blood glucose, FBG)，如果FBG≥16.7 mmol/L 則確定為糖尿病大鼠造模成功。2周、4周和8周后，整晚禁食，腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg 麻醉，處死各組大鼠。血樣收集到含有抗凝劑的試管中。分離肝臟，一部分用2.5% 戊二醛固定，用于透射電鏡觀察；一部位置于10% 的甲醛溶液，用于形態(tài)學(xué)觀察；其余部分儲(chǔ)于-80℃，用于其他實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma)；血糖儀及試紙(美國(guó)強(qiáng)生)，CaSR一抗，強(qiáng)效RIPA裂解液，PAGE凝膠快速制備試劑盒，超敏ECL顯色液，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，AST、ALT測(cè)定試劑盒(南京建成)，BCA定量試劑盒等。

1.3 主要器材

高速低溫離心機(jī)(Beckman), US-640 型紫外分光光度計(jì)(Beckman),Western blot 電泳槽(美國(guó) BIO-RAD)。

1.4 透射電鏡檢測(cè)肝臟超微結(jié)構(gòu)

取肝臟組織切成1mm3，4℃，2.5% 戊二醛固定，1% 鋨酸固定，常規(guī)乙醇、丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鉛鈾雙重染色，透射電鏡下觀察肝臟組織的超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.5 HE和Masson染色檢測(cè)肝臟組織學(xué)變化

取肝組織固定部位置于10% 的甲醛溶液中，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)和馬松(Masson)染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化，其中Masson以藍(lán)色為陽性表達(dá)。

1.6 測(cè)定轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST濃度

將收集到的血樣以4℃、3 000 r/min離心15 min，留取上清。利用試劑盒(南京建城生物工程研究所)測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)的含量，所有試驗(yàn)均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 細(xì)胞模型建立及其分組

HSC系大鼠肝星形細(xì)胞購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司。將該細(xì)胞在含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、100 U/ml 青霉素和100 mg/ml鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 70%～80% 融合時(shí)傳代至6～10代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將HSC細(xì)胞隨機(jī)分成3組(n=5)：正常對(duì)照組(Control)，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的葡萄糖含量為5.6 mmol/L；高糖組(HG)，培養(yǎng)基中加入40 mmol/L葡萄糖；CaSR抑制劑組(HG+Calhex231)，培養(yǎng)基中加入2.5 μmol/L的Calhex231和40 mmol/L葡萄糖共同培養(yǎng)48 h。

1.8 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)情況

取冷凍保存的肝臟組織，稱量100 g置于組織勻漿器中，加入1 ml含PMSF(蛋白酶抑制劑)的RIPA裂解液在冰上勻漿，4℃、13 500 r/min離心25 min，取上清制備組織蛋白提取液；處理48 h后各組肝星形細(xì)胞，按類似方法處理，同樣留取上清，用 BCA 法測(cè)定蛋白含量。用SDS-PAGE 電泳分離蛋白，根據(jù)目的蛋白分子量選擇配制不同濃度的分離膠，上樣，電泳，至溴酚蘭抵達(dá)凝膠底部時(shí)，停止電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫，5% 脫脂牛奶封閉 1 h 后，裁剪目的蛋白所在的條帶。將目的條帶分別置于抗體盒中，加入相應(yīng)的一抗(CaSR、COⅠ、COⅢ、MMP1、MMP2、MMP9按1∶1 000比例配制)，4℃過夜。次日用TBST洗膜，然后加入稀釋過的二抗(1∶10 000)，室溫孵育 1 h，TBST洗膜，ECL法進(jìn)行顯色。應(yīng)用 Image J 圖像處理軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，測(cè)量灰度值，計(jì)算各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、血糖及肝功能的變化

與正常組相比，糖尿病大鼠(2W，4W和8W)空腹血糖明顯升高，體重減輕；ALT、AST也有不同程度的升高(表1)。

Tab. 1 Changes of blood glucose, body weight, ALT and AST in each group ，n=8)

ALT：Alanine aminotransferase; AST：Aspartate aminotransferase

*P<0.05vscontrol group

2.2 各組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化

HE染色光鏡觀察顯示，正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，呈放射狀分布，肝細(xì)胞無明顯變性、壞死，核結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫大變圓，胞漿疏松，部分肝細(xì)胞呈大泡樣改變，中央靜脈周圍或匯管區(qū)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

Fig. 1 HE staining to observe the changes of liver tissue structure(×40)

A: Control; B: 8W

Masson染色主要用于觀察膠原纖維增生情況，以藍(lán)色為陽性表達(dá)。結(jié)果顯示，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，僅中央靜脈和匯管區(qū)有少量細(xì)小的膠原纖維；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，膠原纖維增多增粗，呈彌漫性分布(圖2)。

大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示：正常大鼠肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和內(nèi)含物豐富，線粒體數(shù)量多，與正常組相比，糖尿病大鼠肝細(xì)胞變性，線粒體腫脹，肝內(nèi)出現(xiàn)少量脂肪滴，細(xì)胞間隙產(chǎn)生膠原纖維，細(xì)胞核輕微固縮(圖3)。

Fig. 2 Masson staining to observe the proliferation of collagen fibers in liver tissue

A, C: Control; B, D: 8W; A, B: ×20；C, D: ×40

Fig. 3 Transmission electron microscopic observation of hepatic ultrastructure in each group(×10 000)

A: Control; B: 4W; C: 8W

2.3 Western blot檢測(cè)各組相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3.1 糖尿病大鼠CaSR及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)變化 以CaSR及纖維化相關(guān)蛋白與β-Tubulin的比值為參數(shù)：與正常組相比，模型組膠原Ⅰ(COⅠ)、膠原Ⅲ(COⅢ)、基質(zhì)金屬蛋白酶1、2和9(MMP1、MMP2和MMP9)蛋白表達(dá)增加，CaSR蛋白表達(dá)同樣增加(圖4，表2)。

Fig. 4 Comparison of expressions of CaSR and liver fibrosis-related proteins in each group

CaSR：Calcium sensing receptor；COⅠ：Collagen Ⅰ；COⅢ：Collagen Ⅲ；MMP1：Matrix metalloproteinase I；MMP2：Matrix metalloproteinase II；MMP9：Matrix metalloproteinase 9

2.3.2 Calhex231對(duì)高糖處理HSC細(xì)胞CaSR及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 以CaSR及纖維化相關(guān)蛋白與β-Actin的比值為參數(shù)：與正常組相比，HG組α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、COⅠ、COⅢ、MMP9蛋白表達(dá)增多，HG+Calhex231組上述變化減輕(圖5，表3)。

Fig. 5 Comparison of expressions of CaSR and liver fibrosis-related proteins in each group(n=5)

CaSR：Calcium sensing receptor；α-SMA：Alpha-smooth muscle actin；COⅠ：Collagen Ⅰ；COⅢ：Collagen Ⅲ；MMP9：Matrix metalloproteinase 9

Tab. 2 Analysis of CaSR and fibrosis-related protein expressions in each group, n=5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vs2W group；#P<0.05,##P<0.01vs4W group

Tab. 3 Analysis of CaSR and liver fibrosis-related proteins expressions in each group, n=5)

α-SMA: α-smooth muscle actin

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsHG group

3 討論

糖尿病主要分為1型糖尿病和2型糖尿病[2]。1型糖尿病的胰島自身免疫可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞丟失[10]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，1型糖尿病也可以發(fā)生胰島素抵抗[3]。但是，胰島素缺乏對(duì)肝臟造成的后果知之甚少。最近，越來越多的數(shù)據(jù)支持糖尿病的代謝狀況與病理學(xué)定義的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)存在復(fù)雜的聯(lián)系[11]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，正常人、單純性肥胖患者及肥胖伴2型糖尿病患者內(nèi)臟脂肪組織中存在表達(dá)差異的基因[12]。Targher G等人的研究表明，1型糖尿病患者中NAFLD的患病率高達(dá)50%[13]，糖尿病似乎通過現(xiàn)有的相關(guān)代謝途徑加速了NAFLD向非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)的進(jìn)展，其表現(xiàn)為壞死性炎癥，并伴有不同程度的肝纖維化[11]。肝纖維化是肝臟因各種慢性損傷而發(fā)生的常見過程，是組織發(fā)生修復(fù)反應(yīng)時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)合成、降解與沉積不平衡而引起的病理過程。與肝損傷相關(guān)的因素，例如，病毒性肝炎、脂肪性肝炎(包括酒精性和非酒精性)、自身免疫性肝病、膽汁淤積性疾病以及遺傳和代謝疾病，均可導(dǎo)致肝纖維化[14]。

本實(shí)驗(yàn)通過一次性腹腔注射STZ建立大鼠1型糖尿病模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠空腹血糖在連續(xù)觀察的8周時(shí)間里始終明顯升高，造模2周后模型鼠的體重較正常對(duì)照組大鼠顯著降低?？梢?型糖尿病大鼠模型復(fù)制成功，這為后續(xù)研究打下了基礎(chǔ)。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)是診斷肝臟疾病最常用的酶。ALT主要存在于肝細(xì)胞漿中，在肝內(nèi)酶活性明顯高于血清，因此，少量肝細(xì)胞壞死即可導(dǎo)致血清ALT水平明顯增高。AST主要分布在肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞壞死，AST可從線粒體中釋放出來，進(jìn)而導(dǎo)致血清AST明顯升高[15]。本實(shí)驗(yàn)采用試劑盒測(cè)定血清中ALT和AST的含量，結(jié)果顯示，糖尿病大鼠2周開始ALT和AST均較正常組顯著升高，提示糖尿病大鼠發(fā)生了肝功能障礙。

文獻(xiàn)報(bào)道，糖尿病引起的肝臟病理學(xué)表現(xiàn)主要有肝糖原沉積，脂肪肝，肝硬變，非特異性的細(xì)胞變性及微血管病變[16]。本實(shí)驗(yàn)透射電鏡觀察顯示，糖尿病模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死，線粒體腫脹，細(xì)胞間隙存在大量膠原纖維。HE染色和Masson染色顯示，糖尿病可導(dǎo)致模型大鼠肝臟發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)損傷，尤其以纖維化為主要特征。

為探討CaSR在糖尿病性肝纖維化中的作用，本研究還觀察了模型組肝組織中CaSR與纖維化指標(biāo)的變化。Western blot結(jié)果顯示，模型組COⅠ、COⅢ、MMP1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)隨時(shí)間推移逐漸升高，CaSR的表達(dá)同步上升。這提示，CaSR的表達(dá)上調(diào)可能參與糖尿病大鼠肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。為證實(shí)我們的推論，本文又初步觀察了CaSR抑制劑對(duì)肝星形細(xì)胞活化的影響。結(jié)果顯示，CaSR、α-SMA、COⅠ、COⅢ和MMP9表達(dá)升高，HG+Calhex231可減少上述蛋白的表達(dá)，提示CaSR對(duì)糖尿病大鼠肝損傷可能存在一定的調(diào)控機(jī)制。

綜上本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步觀察到CaSR的激活參與了1型糖尿病肝損傷的過程，這可能與促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化有關(guān)，其具體的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。