劉 姣，周 剛，梅 雨，謝文杰，李鵬飛，楊 帆

(湖南大學(xué)體育學(xué)院，長沙 410082)

運(yùn)動誘導(dǎo)骨骼肌活性氧(reactive oxygen species, ROS)的研究已有數(shù)十年的歷史，早期的研究表明骨骼肌細(xì)胞的線粒體是ROS的主要生成場所，超氧陰離子的生成與線粒體耗氧有關(guān)。然而，最近十余年越來越多的證據(jù)表明，ROS的生成與骨骼肌細(xì)胞的酶系統(tǒng)有關(guān)，尤其是NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)，被認(rèn)為是運(yùn)動刺激骨骼肌ROS生成的主要途徑[1]。

最近有研究表明用電刺激骨骼肌導(dǎo)致ATP釋放，激活P2Y1受體，從而激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)，使NADPH氧化酶活性升高[5]。PKC被激活后可引起一系列靶蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化反應(yīng)，是一種常見的信號傳導(dǎo)途徑?；谧罱难芯砍晒?，本研究重點(diǎn)關(guān)注一次性運(yùn)動對NOX活性與表達(dá)的影響，及PKC是否參與了運(yùn)動誘導(dǎo)的NADPH氧化酶源的ROS生成的調(diào)控。研究假設(shè)：運(yùn)動誘導(dǎo)骨骼肌ROS增高的機(jī)制可能是通過PKC/NOX/ROS這條途徑實(shí)現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材與試劑

實(shí)驗(yàn)動物跑臺(ZH-PT，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)，多功能酶標(biāo)儀(QM40-NIR，奧地利)，電泳系統(tǒng)(北京百晶生物技術(shù)有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(H1850R，湘儀)，10-095勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)，超低溫冰箱(中科美菱)，白屈菜紅堿(上海羽朵生物科技有限公司)，Apocynin(美國Sigma-aldrich公司)，DCFH-DA熒光探針(美國Sigma-aldrich公司)，NADPH、SOD、PMSF、DTT、BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，GAPDH抗體(杭州賢至生物科技有限公司)，PKC抗體(圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Cruz)，NOX2、NOX4抗體、二抗抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，3-NT(3-nitrotyrosine)抗體(美國Sigma-aldrich公司)，Western blot常規(guī)生化試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與研究方案

雄性SD大鼠40只，體重240～260 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號SCXK(湘)2016-0002。分籠飼養(yǎng)，每籠4只，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為24℃±2℃，自由飲食、飲水，自然晝夜變化光照。

本研究分為兩個實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一：30只大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為對照組(C組)、力竭運(yùn)動組(E組)、運(yùn)動+PKC抑制劑組(EC組),其中EC組腹腔注射PKC抑制劑白屈菜紅堿(Chelerythrine)，劑量5 mg/kg體重，C組和E組注射同等劑量生理鹽水，觀察抑制PKC活性對力竭運(yùn)動大鼠骨骼肌NOX的活性與表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)二：30只大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為對照組(C組)、力竭運(yùn)動組(E組)、運(yùn)動+NOX抑制劑組(EA組)，EA組腹腔注射NADPH氧化酶抑制劑Apocynin，劑量10 mg/kg體重，C組和E組注射同等劑量生理鹽水，觀察抑制NOX活性對力竭運(yùn)動大鼠骨骼肌過氧亞硝酸陰離子(peroxynitrite, ONOO-)生成的影響。

運(yùn)動模型[6]為中等強(qiáng)度的大鼠跑臺一次性力竭運(yùn)動，整個動物實(shí)驗(yàn)持續(xù)8 d，具體過程如下：動物購入后靜養(yǎng)3 d；第4～6日，除C組外，其他組的大鼠進(jìn)行3 d跑臺適應(yīng)性運(yùn)動，5 m/min，1次/日，無坡度；第7日，休息，并且各組分別注射抑制劑或生理鹽水；第8日，在運(yùn)動前1 h，動物被第二次注射抑制劑或生理鹽水，然后進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動。運(yùn)動以5 m/min開始，無坡度，按每5 min增加5 m的節(jié)奏，逐漸增加至終強(qiáng)度25 m/min，直到力竭。在運(yùn)動過程中用1 mA以下電流強(qiáng)度刺激，必要時增加銳光和聲音刺激，進(jìn)行強(qiáng)迫運(yùn)動。最后，在大鼠經(jīng)反復(fù)聲光電刺激及人工驅(qū)趕也不能繼續(xù)運(yùn)動，并且觀察到大鼠四肢癱軟，眼神無光，翻轉(zhuǎn)后無法進(jìn)行翻正反射，即確定為達(dá)到力竭狀態(tài)，終止運(yùn)動，平均運(yùn)動時間約為120 min。

1.3 采樣與樣品處理

末次運(yùn)動后，立即將大鼠腹腔注射10%水合氯醛水溶液(0.35 ml/100 g)，心臟取血后處死大鼠。固定大鼠后肢，分離出左右腿的跖肌，置于樣品管后立即液氮冷凍，然后保存在-80℃超低溫冰箱中以備勻漿。

勻漿：稱取組織100 mg左右放于冰上剪碎，按10%(1 mg∶10 μl)比例加入生理鹽水或PBS勻漿液(PH 7.4、5 mmol/L磷酸、250 mmol/L蔗糖、0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF和1 mmol/L DTT)。勻漿后，生理鹽水勻漿管以3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝后-80℃保存，用于ROS和蛋白定量測定；PBS勻漿管以12 000 r/min離心25 min，取上清液分裝，-80℃保存，用于Western blot檢測。

1.4 NADPH氧化酶活性的測定

骨骼肌NADPH氧化酶活性檢測的蛋白定量采用BCA蛋白定量法。

1.5 Western blot

前述PBS勻漿液被用于Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測骨骼肌NOX2、NOX4、3-NT、GAPDH。步驟如下：(1)制備12%丙烯酰胺PAGE膠；(2)上樣量30 μg/30 μl；(3)電泳；(4)轉(zhuǎn)膜，PVDF膜；(5)5%脫脂奶粉封閉；(6)一抗孵育，過夜；(7)TBS-T漂洗；(8)二抗孵育1 h；(9)TBS-T漂洗；(10)ECL顯色；(11)洗片；(12)掃描分析，采用ImageJ軟件分析Western blot 圖片條帶的灰度值，用GAPDH作為內(nèi)參，蛋白表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/GADPH條帶灰度值。

1.6 免疫沉淀

采用共免疫沉淀法檢測PKC-NOX是否形成復(fù)合物。步驟如下：(1)100 mg跖肌+1 000 μl NP-40裂解液(含1 mmol/L PMSF)，勻漿；(2)12 000 r/min離心25 min，取上清；(3)500 ml上清液+5 μl PKC抗體，4°C搖動過夜；(4)加入20 μl protein-A/G beads, 4°C搖動過夜；(5)離心、洗滌，留沉淀用于Western blot 分析；(6)常規(guī)Western blot，步驟見上，抗體為NOX2、NOX4；(7)掃描分析，采用ImageJ軟件分析Western blot 圖片條帶的灰度值，蛋白表達(dá)水平=NOX2(或NOX4)條帶灰度值/PKC條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一次性力竭運(yùn)動對骨骼肌NADPH氧化酶活性的影響

Tab. 1 Effects of Chelerythrine on NADPH oxidase active and protein expression in skeletal muscle of exhausted exercise rats

C: Control group; E: Exhaustive exercise group; EC: Exhaustive exercise plus chelerythrine group; AU: Arbitrary units

*P<0.05，**P<0.01vsC；# #P<0.01vsE

GroupSuperoxideproduction(AU/mgprotein)3-NT/GADPHC8.19±2.182.39±0.92E13.67±2.91??5.03±0.11??EA9.14±1.43##2.86±0.65#

EA: Exhaustive exercise plus apocynin group

**P<0.01vsC；#P<0.05，##P<0.01vsE

2.2 PKC對力竭大鼠骨骼肌NOX表達(dá)的調(diào)節(jié)

NOX家族中的NOX2和NOX4被報道在骨骼肌細(xì)胞中有較高表達(dá)，并且受骨骼肌收縮調(diào)節(jié)。但是，在運(yùn)動刺激下，NOX2和NOX4的上游調(diào)節(jié)機(jī)制并不清楚。

本研究觀察到，安靜狀態(tài)下，NOX2和NOX4表達(dá)均不高，但在一次性力竭運(yùn)動后，如表1、圖1所示，與C組相比，NOX2和NOX4的表達(dá)均顯著增高(P<0.01，P<0.05)。與E組相比，在施加PKC抑制劑的EC組，NOX2的表達(dá)顯著下降(P<0.01)，但NOX4表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)，提示力竭運(yùn)動狀態(tài)下，NOX2的蛋白表達(dá)受PKC調(diào)控，而NOX4的蛋白表達(dá)不受PKC的影響。

Fig. 1 Effects of exhaustive exercise on the expressions of NOX2 and NOX4 in skeletal muscles

C: Control group; E: Exhaustive exercise group; EC: Exhaustive exercise plus chelerythrine group

2.3 骨骼肌PKC-NOX2/NOX4免疫共沉淀分析

我們采用PKC-NOX2/NOX4免疫共沉淀方法進(jìn)一步驗(yàn)證PKC與NOX2或NOX4是否形成復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)先進(jìn)行PKC的免疫沉淀，然后采用Western blot分析沉淀物中的NOX2、NOX4。結(jié)果如表1、圖2所示，與C組相比，NOX2、NOX4在力竭狀態(tài)下均顯著增加(P<0.01，P<0.05)，而施加抑制劑的EC組均無顯著性差異(P>0.05)，提示一次性力竭運(yùn)動導(dǎo)致了PKC-NOX2、PKC-NOX4復(fù)合物的形成。

Fig. 2 Analysis of PKC-NOX2, PKC-NOX4 co-immunoprecipitation in skeletal muscle

C: Control group; E: Exhaustive exercise group; EC: Exhaustive exercise plus chelerythrine group

2.4 力竭運(yùn)動誘導(dǎo)骨骼肌過氧亞硝酸陰離子生成

運(yùn)動誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞生成的過量ROS可與一氧化氮合酶催化生成的一氧化氮(nitric oxide, NO)快速反應(yīng)，生成具有更強(qiáng)氧化作用的 ONOO-。骨骼肌中ONOO-半衰期極短，ONOO-可使蛋白質(zhì)酪氨酸硝化，生成3-NT，可通過檢測3-NT間接反映ONOO-生成量。由表2、圖3可見，與C組相比，E組3-NT生成量顯著上升，而施加NADPH氧化酶抑制劑的EA組較E組3-NT生成量減少，提示NADPH氧化酶途徑生成的ROS后續(xù)導(dǎo)致了ONOO-的增加。

3 討論

本研究旨在探明一次性力竭運(yùn)動誘導(dǎo)的骨骼肌ROS的來源，了解NADPH氧化酶的不同亞型在運(yùn)動誘導(dǎo)的骨骼肌ROS生成中的作用，并研究運(yùn)動激活骨骼肌NADPH氧化酶的上游信號。本研究的主要發(fā)現(xiàn)有：一次性力竭運(yùn)動增加骨骼肌NOX2和NOX4的蛋白表達(dá)；PKC介導(dǎo)了運(yùn)動誘導(dǎo)的NOX2源的ROS增加。

Fig. 3 Exhaustive exercise induces skeletal muscle peroxynitrite production

C: Control group; E: Exhaustive exercise group; EA: Exhaustive exercise plus apocynin group

我們的研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動顯著提升了骨骼肌ROS水平，但施加NADPH氧化酶抑制劑apocynin后，ROS生成量未見增高，說明運(yùn)動誘導(dǎo)的骨骼肌ROS源于NADPH氧化酶。這一發(fā)現(xiàn)與近年的一些研究結(jié)論一致，即骨骼肌中的NADPH氧化酶途徑是運(yùn)動誘導(dǎo)的骨骼肌中ROS的主要來源[1]。然而，運(yùn)動對骨骼肌中存在的NADPH氧化酶兩種亞型NOX2和NOX4的蛋白表達(dá)與活性的影響并不清楚。

骨骼肌中的NOX2由兩個催化亞基和四個調(diào)節(jié)亞基組成，催化亞基gp91phox和p22phox主要定位于細(xì)胞膜和橫管，而調(diào)節(jié)亞基p47phox、p67phox、p40phox和Rac主要存在于細(xì)胞漿[8]，在細(xì)胞受到刺激后，胞質(zhì)亞基易位至膜，組裝成完整的酶，進(jìn)而催化功能被激活，導(dǎo)致ROS生成[9]。Carlos等[10]采用apocynin作NADPH氧化酶抑制劑的小鼠急性60 min游泳實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動導(dǎo)致趾短屈肌中調(diào)節(jié)亞基p47phox磷酸化水平顯著上調(diào)，并且共免疫沉淀檢測到gp91phox-p47phox復(fù)合物形成，提示NOX2的活化在急性運(yùn)動引起氧化應(yīng)激反應(yīng)中起到重要作用。最近一項大鼠跑臺實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一次較大強(qiáng)度的力竭性運(yùn)動誘導(dǎo)gp91phox和p22phox mRNA的表達(dá)，進(jìn)而NADPH氧化酶活性增加，催化生成過量ROS，并且NOX2受上游信號分子PKCδ的調(diào)控[11]。

PKC是一類使底物蛋白分子內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化的蛋白激酶家族，其中PKCα、β、δ和ζ被報道與NOX2的調(diào)節(jié)亞基p47phox磷酸化有關(guān)[12]。我們的研究中，給力竭運(yùn)動大鼠施加PKC抑制劑白屈菜紅堿后，跖肌ROS生成顯著減少，并且，白屈菜紅堿可抑制力竭運(yùn)動導(dǎo)致的PKC-NOX2復(fù)合物生成增加，說明NOX2的激活與PKC的調(diào)控有關(guān)。關(guān)于力竭運(yùn)動對PKC的影響，已有研究顯示[13]，力竭運(yùn)動可增加大鼠心肌PKCα、δ和ζ蛋白表達(dá)水平，以及PKCα和PKCδ的磷酸化水平，提示PKC的表達(dá)與活化可能是力竭運(yùn)動導(dǎo)致心肌損傷重要調(diào)控因素。進(jìn)一步的研究顯示，電刺激可以增強(qiáng)PKC-NOX2途徑的ROS生成[5]。因此，通過我們的研究及已有研究報道可以推論，力竭運(yùn)動通過PKC-NOX2途徑促進(jìn)骨骼肌ROS生成。

本研究還發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動增強(qiáng)了跖肌NOX2的蛋白水平，并且施加PKC抑制劑后，NOX2表達(dá)降低，提示PKC介導(dǎo)了力竭運(yùn)動增強(qiáng)的NOX2表達(dá)，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。已有研究表明，NOX2和NOX4在骨骼肌的活性和表達(dá)存在纖維類型差異，并且運(yùn)動可以增強(qiáng)NOX2和NOX4在骨骼肌中的活性和mRNA表達(dá)[4]。

一些病理性研究表明，骨骼肌的NOX4mRNA和蛋白水平在某些疾病狀態(tài)下增加，如心臟病、腫瘤、老年性肌肉萎縮癥等[14]。最新的一項研究顯示，高糖培養(yǎng)上調(diào)施旺細(xì)胞NOX4mRNA及蛋白表達(dá)，降低施旺細(xì)胞活性，增加細(xì)胞內(nèi)ROS含量，通過增加 Caspase3mRNA及蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動導(dǎo)致骨骼肌NOX4蛋白水平也顯著增加，其變化與ROS的增高一致，說明非病理性的運(yùn)動刺激也能導(dǎo)致NOX4表達(dá)增加。Matthew等[16]的一項小鼠急性跑臺運(yùn)動實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一次性運(yùn)動后，普通運(yùn)動小鼠線粒體NOX4mRNA和蛋白水平均顯著升高，而采用NOX4敲除小鼠做力竭運(yùn)動實(shí)驗(yàn)，NOX4敲除鼠的運(yùn)動距離和運(yùn)動時間均顯著低于正常小鼠。說明NOX4表達(dá)增加從而產(chǎn)生ROS是運(yùn)動刺激后細(xì)胞的正常生理反應(yīng)。一些細(xì)胞因子或激素可以上調(diào)NOX4的蛋白表達(dá)[14]，包括IGF-1、血管緊張素II、TNF-α、TGF-β等。而運(yùn)動實(shí)驗(yàn)表明，這些因子均可因受到運(yùn)動刺激而上調(diào)，因此，骨骼肌NOX4蛋白表達(dá)的增加，可能與運(yùn)動誘導(dǎo)的這些因子的增加有關(guān)。

此外，PKC也被發(fā)現(xiàn)對NOX4有調(diào)節(jié)作用，如PKCα可上調(diào)NOX4的表達(dá)[17]。有研究表明，PKC介導(dǎo)NOX4過度表達(dá)參與腎小球硬化和細(xì)胞外基質(zhì)的重建，最終誘導(dǎo)糖尿病腎病的發(fā)生[18]。在我們的研究中，盡管檢測到力竭運(yùn)動使骨骼肌NOX4蛋白水平上升，但施加PKC抑制劑的力竭組NOX4表達(dá)依然高于安靜組，與普通運(yùn)動組無顯著性差異，說明PKC并不直接介導(dǎo)運(yùn)動導(dǎo)致的骨骼肌NOX4的蛋白表達(dá)。我們進(jìn)一步研究PKC與NOX4共免疫沉淀發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動使骨骼肌形成PKC-NOX4復(fù)合物，說明二者間一定發(fā)生了相互作用。而在PKC抑制劑組，并未觀察到PKC-NOX4復(fù)合物增加。據(jù)此可以推測PKC激活了NOX4，從而產(chǎn)生ROS。盡管與NOX2的激活需調(diào)節(jié)亞基p47phox的磷酸化激活不同，NOX4具有自發(fā)活性，它的催化能力受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，但仍然存在誘導(dǎo)活性的方式，已經(jīng)顯示有幾種蛋白可以調(diào)節(jié)其活性[19]。與NOX2一樣，NOX4也需要與p22phox結(jié)合構(gòu)成功能基團(tuán)才能起到催化產(chǎn)生ROS的作用。因此，p22phox可能是PKC被激活的適宜位點(diǎn)。p22phox表達(dá)的缺失使Nox4在其表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化的情況下失活，而增加p22phox的表達(dá)也可以刺激增加的NOX4活性[19]。運(yùn)動刺激下，PKC可能通過激活p22phox從而激活NOX4。盡管還沒有NOX4被直接磷酸化的證據(jù)，但NOX4氨基酸序列的分析表明，NOX4存在眾多磷酸化位點(diǎn)[19]。

綜上所述，本研究通過力竭運(yùn)動與施加NADPH抑制劑或PKC抑制劑的實(shí)驗(yàn)動物模型，發(fā)現(xiàn)一次性力竭運(yùn)動可通過激活NADPH氧化酶，產(chǎn)生過量ROS；力竭運(yùn)動可使骨骼肌中的NADPH氧化酶的兩種亞型NOX2和NOX4的表達(dá)顯著上升，PKC通過調(diào)控NOX2活性與表達(dá)介導(dǎo)骨骼肌ROS的生成。研究提示一次性力竭運(yùn)動主要通過PKC/NOX2/ROS途徑介導(dǎo)了骨骼肌氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，基于力竭運(yùn)動也導(dǎo)致骨骼肌PKC-NOX4復(fù)合物的增加，也不排除PKC對NOX4活性具有調(diào)控作用，這是未來進(jìn)一步研究需要關(guān)注的。