彭志鋒，張繼紅，楊德兵

(1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，2.解剖教研室，山西 大同 037009)

缺血性腦卒中是由血管阻塞引起的大腦供血不足，是導(dǎo)致身體殘疾主要原因。許多臨床實(shí)踐指南建議在腦卒中后盡早開始運(yùn)動(dòng)，以促進(jìn)身體殘疾恢復(fù)[1]。

根據(jù)神經(jīng)元損傷模式，大腦缺血區(qū)域可分為缺血核心區(qū)和半影區(qū)。由于缺血半影區(qū)神經(jīng)元損傷較輕，有恢復(fù)的可能，因而成為各種干預(yù)治療的靶點(diǎn)[2]。此外，在急性缺血性損傷后，缺血區(qū)神經(jīng)元可通過激活凋亡途徑發(fā)生再一步損傷[3]。因而保護(hù)缺血半影區(qū)神經(jīng)元凋亡是一種潛在改善缺血性腦卒中后恢復(fù)的策略。因此，在本研究目的是觀察早期跑步運(yùn)動(dòng)是否通過調(diào)節(jié)缺血半影區(qū)神經(jīng)元凋亡在大鼠缺血/再灌注損傷模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性SD大鼠(240-280 g)，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(晉)2009-0001)。室內(nèi)溫度保持在(23±2)℃左右，明暗周期12 h，自由飲水和進(jìn)食。在研究過程中對(duì)大鼠處理均按照國(guó)家頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》和山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)的要求嚴(yán)格執(zhí)行。將SD大鼠隨機(jī)分成4組：假手術(shù)+安靜組(Sham-St,n=15)(240～280 g)、假手術(shù)+運(yùn)動(dòng)組(Sham-Ex,n=15)(240～280 g)、缺血+運(yùn)動(dòng)組[大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)-Ex,n=15)(240～280)g和缺血+安靜組(MCAO-St,n=15)(240～280)g。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

顯微鏡(日本Olympus公司)；電動(dòng)跑步機(jī)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染料(美國(guó)Sigma公司)；Caspase-3抗體(美國(guó)Sigma公司)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.3 大鼠腦缺血/再灌模型

采用腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.06 g/kg)麻醉大鼠。剪毛后頸部手術(shù)。在顯微鏡下分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。然后用縫合線結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，用針頭在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端動(dòng)脈壁上扎一個(gè)小口，將準(zhǔn)備好的線栓從頸外動(dòng)脈小孔插入頸總動(dòng)脈，通過頸內(nèi)動(dòng)脈最后到達(dá)大腦中動(dòng)脈，用縫合線固定線栓，MCAO后1 h 拔出線栓，縫合皮膚。MCAO手術(shù)成功率約為70%。假手術(shù)組大鼠按上述步驟進(jìn)行手術(shù)操作，但不插入線栓。在MCAO后7 d處死大鼠，提取各組大鼠缺血半影區(qū)進(jìn)行分析。缺血病灶與周圍正常腦組織之間有一形態(tài)和結(jié)構(gòu)過渡區(qū),該區(qū)著色和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)界于病灶和正常腦組織之間,即缺血半影區(qū)。

1.4 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方法

采用ZH-PT型電動(dòng)跑步機(jī)用于大鼠運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。在進(jìn)行MCAO手術(shù)前，訓(xùn)練運(yùn)動(dòng)組大鼠在跑步機(jī)上進(jìn)行3 d適應(yīng)，10 min/d。MCAO手術(shù)48 h后，MCAO-Ex和Sham-Ex大鼠連續(xù)5 d進(jìn)行跑步運(yùn)動(dòng)(15 m/min，30 min/d)。而MCAO-St和Sham-St大鼠不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)方法

MCAO后再灌7 d，采用5分制神經(jīng)分級(jí)(0-4)評(píng)估神經(jīng)缺損。0=無明顯神經(jīng)缺損；1=右側(cè)前肢彎曲；2=當(dāng)尾巴被牽拉時(shí)，右前肢握力下降；3=當(dāng)尾巴被牽拉時(shí)，向右轉(zhuǎn)圈；4=自發(fā)向右轉(zhuǎn)圈[4]。

1.6 大鼠腦TTC染色方法

行為學(xué)評(píng)分后將大鼠迅速斷頭取腦，放入-20℃冰箱冷凍約15 min后，行冠狀切片，厚度為1.5 mm。將切好的腦片迅速放入準(zhǔn)備好的1% 的TTC磷酸鹽緩沖液中，在37℃水浴中避光孵育10 min。腦梗死區(qū)域不染色(灰白色)，而正常腦組織染為深紅色。依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5]方法計(jì)算MCAO后腦梗死體積。

1.7 大鼠腦TUNEL分析神經(jīng)元凋亡情況

按照TUNEL試劑盒的操作步驟檢測(cè)各組大鼠缺血半影區(qū)神經(jīng)元凋亡(n=5)。TUNEL陽性細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上被認(rèn)為是凋亡神經(jīng)元。每只大鼠顯微鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野計(jì)數(shù)TUNEL陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，然后取平均值。

1.8 大鼠腦免疫印記分析Caspase-3表達(dá)水平

神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，將大鼠迅速斷頭取腦，提取大鼠缺血半影區(qū)蛋白，按10 ml/g比例加入全細(xì)胞裂解液[mmol/L：Tris-Cl 50(pH 7.5)，乙二醇雙四乙酸，乙二胺四乙酸，二巰基蘇糖醇，Na4P2O75，岡田酸5×10-5，高肽酶素、抑肽酶、胃酶抑素A、糜蛋白酶抑制素各5 mg/L，2%SDS]。勻漿、超聲破碎，待組織細(xì)胞全部溶解后。BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入Loading Buffer制備成電泳樣品。取30g進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%牛奶孵育1 h。用兔源Caspase-3(1∶2 000)和鼠抗-actin多克隆抗體(1∶2 000)4 ℃孵育3 h。用PBS-T稀釋山羊抗兔和山羊抗鼠二抗(1∶ 25 000)，室溫孵育1 h。利用化學(xué)發(fā)光掃描系統(tǒng)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)并攝片，采用Quantity one圖像分析軟件對(duì)目標(biāo)條帶吸光度積值進(jìn)行分析，以-tubulin條帶吸光度積值做為參照，兩者比值為目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

對(duì)缺血/再灌大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)觀察，Sham-St和Sham-Ex大鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)正常。缺血/再灌損傷使MCAO-St和MCAO-Ex大鼠神經(jīng)行為學(xué)功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著增高，但MCAO-Ex大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分又明顯低于MCAO-St大鼠(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Neurobehavioral scores and infarction volume of rats in each group

GroupScore(n=15)Infarctionvolume(%,n=5)Sham-St00Sham-Ex00MCAO-St 2.7±0.5? 45.0±5.8?MCAO-Ex 1.8±0.3?# 27.6±3.9?#

*P<0.05vssham;#P<0.05vsMCAO-St

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較

各組大鼠腦梗死體積如圖1所示，Sham組大鼠均無腦梗死。缺血/再灌損傷使MCAO-St和MCAO-Ex大鼠出現(xiàn)明顯腦梗死，但MCAO-Ex大鼠腦梗死體積顯著低于MCAO-St大鼠(P<0.05, 表1)。

Fig. 1 Typical TTC staining in each group

2.3 TUNEL分析大鼠腦缺血半影區(qū)神經(jīng)元凋亡情況

采用TUNEL方法分析各組大鼠缺血半影區(qū)凋亡情況表明，Sham-St和Sham-Ex大鼠未檢測(cè)到TUNEL陽性細(xì)胞(圖2)。缺血/再灌損傷使MCAO-St和MCAO-Ex大鼠缺血半影區(qū)發(fā)生凋亡，但MCAO-Ex大鼠凋亡陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于MCAO-St大鼠(P<0.05，表2)。

Fig. 2 Typical TUNEL staining in each group(Uncoulored ×40)

Tab. 2 Apoptotic cells and Caspase-3 protein levels of rats in each group(n=5)

GroupApoptoticcells(number/field)Caspase-3(%)Sham-St0 4.8±0.5Sham-Ex0 4.9±0.8MCAO-St 80.0±9.0? 18.6±4.0?MCAO-Ex 60.0±5.0?# 10.0±3.4?#

*P<0.05vssham;#P<0.05vsMCAO-St.

2.4 免疫印記分析大鼠腦缺血半影區(qū)Caspase-3表達(dá)

采用免疫印記方法分析各組大鼠缺血半影區(qū)Caspase-3表達(dá)的結(jié)果表明，MCAO-St和MCAO-Ex大鼠Caspase-3表達(dá)均顯著高于Sham-St和Sham-Ex大鼠(P<0.05)，但MCAO-Ex大鼠Caspase-3表達(dá)顯著低于MCAO-St大鼠(P<0.05，圖3)。

Fig. 3 Typical immunoblotting images in rats of each group

3 討論

本研究主要觀察早期跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)行為學(xué)損傷和腦梗死體積的影響。同時(shí)評(píng)估各組大鼠缺血半影區(qū)凋亡發(fā)生情況。研究結(jié)果表明，早期跑步運(yùn)動(dòng)可減少缺血/再灌注損傷大鼠腦梗死體積，并改善神經(jīng)行為學(xué)損傷。此外，早期跑步運(yùn)動(dòng)可降低缺血/再灌注大鼠缺血半影區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)及Caspase-3表達(dá)。上述結(jié)果提示，早期跑步運(yùn)動(dòng)可能通過調(diào)節(jié)凋亡在缺血/再灌注損傷大鼠中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

大鼠缺血區(qū)根據(jù)神經(jīng)元損傷模式可分為缺血核心區(qū)和半影區(qū)，缺血核心區(qū)神經(jīng)元立即壞死，很少能被挽救；相反，半影區(qū)神經(jīng)元缺血損傷相對(duì)較輕[6]。因此，半影區(qū)可能在缺血后恢復(fù)，被認(rèn)為是治療干預(yù)的靶點(diǎn)。此外，在大腦急性缺血性損傷后，半影區(qū)可通過炎癥反應(yīng)和凋亡發(fā)生再一步損傷[7]。因此，抑制半影區(qū)炎癥和凋亡可促進(jìn)神經(jīng)元恢復(fù)正常。楊林等人也證實(shí)，大鼠缺血性卒中后早期運(yùn)動(dòng)可通過抑制急性神經(jīng)炎癥反應(yīng)改善缺血區(qū)大腦損傷[8]。本研究表明，早期運(yùn)動(dòng)可降低缺血/再灌注大鼠缺血半影區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)及Caspase-3表達(dá)。Caspase信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥因子、氧化應(yīng)激、鈣失調(diào)和興奮性毒性是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的主要原因[9]。我們的結(jié)果表明，早期運(yùn)動(dòng)可通過抑制Caspase信號(hào)途徑，從而調(diào)節(jié)缺血半影區(qū)的神經(jīng)元凋亡。然而，具體的機(jī)制仍然不清楚。下一步需要檢測(cè)各組大鼠細(xì)胞色素-c、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor, AIF)、熱休克蛋白-70(heat shock protein, HSP-70)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal- regulated kinase 1/2, ERK1/2)表達(dá)。

以往研究表明，早期運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)缺血性卒中大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。Coleman等人報(bào)告稱，在中風(fēng)2周內(nèi)進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練有助于患者受損運(yùn)動(dòng)功能的改善[10]。Yang等人發(fā)現(xiàn)MCAO大鼠24 h后開始2周運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)大鼠的運(yùn)動(dòng)和空間記憶恢復(fù)[11]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，腦梗死后康復(fù)治療介入時(shí)間越早，神經(jīng)功能恢復(fù)越好，后遺癥并發(fā)癥越少。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血后24 h開始運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，其神經(jīng)功能較模型組明顯恢復(fù)[12]。本研究表明，大鼠腦缺血后48 h開始運(yùn)動(dòng)，MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于不運(yùn)動(dòng)MCAO大鼠，這與上述研究是一致的。一些可能的機(jī)制被用來解釋早期運(yùn)動(dòng)的積極作用。以前的研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)血管生成，增加微血管密度，改善大腦血供，從而減少腦梗死體積[13,14]。

綜上所述，我們的結(jié)果表明，早期跑步運(yùn)動(dòng)可顯著降低大鼠腦缺血/再灌注損傷的梗死體積，并改善神經(jīng)功能損傷；此外可降低TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)及Caspase-3表達(dá)。本研究提示，腦缺血后早期運(yùn)動(dòng)可能通過調(diào)節(jié)凋亡途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。