劉飛 ，甘奇超 ，袁淵 ，王偉 ，安小平 ，沈財祥 ，付憲冬

（1.重慶多普泰制藥股份有限公司，重慶 萬盛 400800；2.重慶銘實農業(yè)科技開發(fā)有限公司，重慶 萬盛 400800）

水蛭作為一種傳統(tǒng)中藥，具有破血、通經(jīng)、逐瘀的功效，最早見于《神農本草經(jīng)》[1]，近年來臨床研究表明，水蛭還具有抗血栓[2]、抗炎癥[3]、抗腫瘤[4]、抗動脈粥樣硬化[5]等作用。日本醫(yī)蛭（Hirudo nipponica Whitman,1886）屬于環(huán)節(jié)動物門，醫(yī)蛭科，醫(yī)蛭屬[6]，別名水蛭，稻田醫(yī)蛭[7]。是目前《中國藥典》唯一收錄的以動物血液為食物來源的水蛭藥材種類，其體內所含有的水蛭素，是一種極強的天然抗凝血酶類物質，其凝血酶的抑制作用是人工重組水蛭素的10倍，且沒有人工重組水蛭素的出血等副作用[8]。

由于日本醫(yī)蛭藥用價值及經(jīng)濟價值的不斷提升，人類對其胡亂抓捕現(xiàn)象越來越嚴重，再加上環(huán)境惡化導致日本醫(yī)蛭野生數(shù)量逐步減少，因此日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖行業(yè)逐漸興起，且養(yǎng)殖規(guī)模日益擴大。但在人工養(yǎng)殖過程中，由于餌料充足日本醫(yī)蛭一次進食量過大，加上其喜攀附于箱壁，運動量很少，導致餌料長期積于體內，消化周期長，生長緩慢。并且腸道中還容易滋生有害細菌，誘發(fā)腸炎等疾病，造成日本醫(yī)蛭大量吐血死亡。

有益微生物能很好的在動物腸道內定植并迅速生長繁殖成一定數(shù)量，形成優(yōu)勢菌，維持腸道菌群的高水平穩(wěn)定，具有調節(jié)動物腸道失調，預防腸道疾病的作用。唐寶英等研究證實利用丁酸梭菌能使草魚增重率大幅提高[9]，張彬等利用硝化細菌、光和細菌和EM菌凈化菲牛蛭養(yǎng)殖水體，對菲牛蛭存活率有明顯的提高作用[10]，但日本醫(yī)蛭餌料中添加有益微生物還未見報道。

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是一種產乳酸革蘭氏陽性菌，其普遍存在于人和動物腸道內，具有改善動物營養(yǎng)代謝，提高免疫功能，增加攝食、促生長等功能[11-13]，是我國農業(yè)部在《飼料添加劑品種目錄2013》中明確規(guī)定可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）是一種厭氧革蘭氏陽性芽孢桿菌，人和動物腸道內的正常菌群，具有調節(jié)腸道微生態(tài)平衡，增強免疫、促生長等作用[14]。該研究在日本醫(yī)蛭的餌料中添加糞腸球菌和丁酸梭菌，從而檢驗2種腸道有益菌對日本醫(yī)蛭成活率和增重率的影響，確定2種腸道有益菌的最佳投喂?jié)舛?，為日本醫(yī)蛭及其他吸血類水蛭的人工養(yǎng)殖提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

日本醫(yī)蛭采集于河北、山東地區(qū)，健康無病，每條平均體質量0.25 g，采集后的日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖于120 cm×60 cm×50 cm聚乙烯塑料箱中，箱底設有40目防逃網(wǎng)，養(yǎng)殖用水來自地下井水，水溫20～24℃，溶氧為5.8～8.2 mg/L，pH 值為 7.1～7.3。

1.2 有益微生物的培養(yǎng)

兩種菌種均來自廣東鶴山市龍之品生物科技有限公司，糞腸球菌接種于胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基，37℃條件下進行活化和擴繁培養(yǎng)，丁酸梭菌接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)。將所得的兩種菌發(fā)酵液用生理鹽水稀釋，進行活菌計數(shù)，計算總菌體數(shù)量。然后4 000 r/min離心15 min，棄去上清液，以無菌生理鹽水洗滌，再4 000 r/min離心15 min，棄去上清液，獲得沉淀菌體。然后用無菌生理鹽水稀釋到確定濃度（CFU/mL），得到已知濃度的糞腸球菌和丁酸梭菌菌懸液，混合菌利用該兩種菌等比例配比而成。

1.3 試驗方法

用已知濃度的菌液再以新鮮豬血為基礎餌料配比成不同濃度的有益微生物作為該試驗的考察因素（表1），以日本醫(yī)蛭的存活率、增重率做評價指標，并參照0#對照組，優(yōu)選兩種有益菌與日本醫(yī)蛭食用餌料的最佳配比。

選取健康的日本醫(yī)蛭進行分箱養(yǎng)殖，每箱4 000尾日本醫(yī)蛭，均重在0.25 g，并設3組試驗平行。將新鮮豬血和已知濃度菌液灌制到豬小腸中進行投喂，投喂飼料量按照每箱日本醫(yī)蛭5L進行投喂。飼養(yǎng)周期為30d（2019年5月6日到2019年6月6日），投喂頻率為1次/7 d，共計4次。試驗養(yǎng)殖過程中觀察日本醫(yī)蛭活動狀態(tài)，保持室內安靜，做好遮光措施，避免強光照射，每天沖洗養(yǎng)殖箱，及時挑出死亡水蛭，保持養(yǎng)殖箱的清潔。

1.4 樣品采集和數(shù)據(jù)分析

日本醫(yī)蛭放入養(yǎng)殖箱前，稱量所有日本醫(yī)蛭總體質量（精確到0.01 g），計算日本醫(yī)蛭個體平均質量，并且還需稱量每箱醫(yī)蛭的總體重量，稱量前用濕潤的紗布或綿柔紙巾除去醫(yī)蛭表面水分和贓物。試驗開始后，每次餌料投喂前后按試驗分組分別統(tǒng)計日本醫(yī)蛭的總體質量和箱內醫(yī)蛭剩余條數(shù)，計算日本醫(yī)蛭的體重增重率和成活率。最后按照體質量增重率和成活率確定糞腸球菌和丁酸梭菌的最佳添加濃度。

試驗結果數(shù)值用“平均值±標準差”表示，采用SPSS 17.0在a=0.05水平下進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后組間兩兩比較顯著性差異。體質量增重率和成活率見公式一、二。

公式一：體質量增重率W（%）=（W2-W1）/W1×100%

公式二：成活率 S（%）=（S2-S1）/S1×100%

W1：每次投喂前日本醫(yī)蛭平均個體質量（g）；W2：每次投喂7 d后日本醫(yī)蛭平均個體質量（g）；S1：試驗開始時日本醫(yī)蛭的尾數(shù)（尾）；S2：每次投喂7 d后日本醫(yī)蛭剩余尾數(shù)（尾）。

表1 微生物濃度水平表

2 結果

2.1 餌料中添加糞腸球菌和丁酸梭菌對日本醫(yī)蛭成活率的影響

由表2可知，餌料中添加糞腸球菌，各組在試驗期間成活率有一定差異，試驗3#組成活率最高，為95.60%±2.56%，其次是2#組，為94.80%±1.94%，成活率最低的是0#組，為90.21%±2.15%。由表3可知，餌料中添加丁酸梭菌，試驗2#組成活率最高，為96.10%±1.08%，其次是3#組，為94.40%±2.45%。由表4可知，餌料中添加糞腸球菌與丁酸梭菌混合菌，試驗2#組成活率最高，為99.50%±0.28%，其次是1#組，為97.30%±0.82%。試驗結束時3種添加方式日本醫(yī)蛭成活率最高組是餌料中添加糞腸球菌和丁酸梭菌混合菌，為99.50%±0.28%，單獨添加糞腸球菌和丁酸梭菌日本醫(yī)蛭的最高成活率分別是95.60%±2.56%與96.10%±1.08%，兩者沒有統(tǒng)計學意義差異（P>0.05）。

表2 餌料中添加糞腸球菌日本醫(yī)蛭的成活率

表3 餌料中添加丁酸梭菌日本醫(yī)蛭的成活率

表4 餌料中添加糞腸球菌與丁酸梭菌混合菌日本醫(yī)蛭的成活率

2.2 餌料中添加糞腸球菌和丁酸梭菌對日本醫(yī)蛭體質量增長率的影響

由表5、表6、表7可知，第一次餌料投喂，試驗各組日本醫(yī)蛭體質量增長率明顯高于后幾次餌料投喂，各組在試驗期間也存在明顯差異，由表5可知，餌料中添加糞腸球菌，試驗3#組體質量總增長率最高，為500.00%±8.62%，顯著高于0#、1#、2#、4#（P<0.05），其次是 2#組，為 428.41%±8.84%，最低的是0#組，為272.12%±9.22%。由表6可知，餌料中添加丁酸梭菌，試驗3#組體質量總增長率最高，為508.65%±8.22%，顯著高于0#、1#、2#、4#（P<0.05），其次是4#組，為424.33%±9.98%。由表7可知，餌料中添加糞腸球菌與丁酸梭菌混合菌，試驗2#組體質量總增長率最高，為 612.35%±5.88%，顯著高于 0#、1#、3#、4#（P<0.05），其次是1#組，為532.66%±6.52%。試驗最終3種添加方式日本醫(yī)蛭體質量總增重率最高是餌料中添加糞腸球菌和丁酸梭菌混合菌，為612.35%±5.88%，顯著高于其他兩種添加方式（P<0.05），餌料中單獨添加糞腸球菌和丁酸梭菌體質量總增重率最高分別是500.00%±8.62%，508.65%±8.22%，兩者沒有統(tǒng)計學意義差異（P>0.05）。

3 討論

隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，人工集約化程度不斷加深，養(yǎng)殖過程中疾病爆發(fā)也越來越頻繁，雖然抗生素和傳統(tǒng)化學藥物療效顯著，但多會在動物體內殘留，給食品、藥品帶來安全隱患，長期使用還導致耐藥菌滋生。微生態(tài)制劑不僅能夠抑制有害細菌，調節(jié)動物腸道微生態(tài)環(huán)境，還能提高水產動物的品質和產量。據(jù)報道，納豆芽孢桿菌能顯著提高鯉魚腸道蛋白酶和肝胰臟蛋白酶的活性[15]，芽孢桿菌能顯著提高大菱鲆和斑節(jié)對蝦的成活率和增重率[16-17]，微生態(tài)制劑能顯著提高肉雞的平均體質量和降低病死率[18]。但是微生態(tài)制劑在日本醫(yī)蛭的養(yǎng)殖中報道較少，該試驗選取糞腸球菌和丁酸梭菌，從而找到能降低日本醫(yī)蛭死亡率和提高日本醫(yī)蛭產量的最佳配比濃度。

表5 餌料中添加糞腸球菌日本醫(yī)蛭的增重率

表6 餌料中添加丁酸梭菌日本醫(yī)蛭的增重率

表7 餌料中添加糞腸球菌與丁酸梭菌混合菌日本醫(yī)蛭的增重率

3種微生物添加方式的試驗中，第一次餌料投喂后日本醫(yī)蛭體重增重率都要顯著高于后期餌料投喂后日本醫(yī)蛭的體重增重率，表明日本醫(yī)蛭在自然條件下基本是處于一個饑餓狀態(tài)，同時饑餓狀態(tài)時的攝食量比正常養(yǎng)殖狀態(tài)下的攝食量要高，這跟張濤[19]2017年的研究結果一致。從表2～表7的試驗結果表明，添加微生物的試驗組與0組比較，日本醫(yī)蛭的成活率與體質量增重率都有所提高，可能原因有以下幾點：一是糞腸球菌和丁酸梭菌在日本醫(yī)蛭體內能迅速繁殖成一定數(shù)量，形成優(yōu)勢菌，促進乳酸菌等有益菌的繁殖，抑制大腸桿菌等致病菌的增殖，維持腸道菌群的高水平穩(wěn)定；二是糞腸球菌和丁酸梭菌能刺激日本醫(yī)蛭腸道黏膜免疫活性，提高日本醫(yī)蛭的免疫功能，增加了其防病、抗病能力；三是糞腸球菌和丁酸梭菌在日本醫(yī)蛭腸道內能產生多種維生素、氨基酸和酶類物質，這不光給宿主提供了更多的營養(yǎng)物質還有助于機體更好的對營養(yǎng)消化吸收。

從試驗結果分析，糞腸球菌和丁酸梭菌混合菌對日本醫(yī)蛭成活率、體質量增重率的促進作用都要優(yōu)于單獨添加糞腸球菌和丁酸梭菌，這與杜宣[13]2006年利用復合微生態(tài)制劑對鯉魚消化酶活力的影響結果一致，也是復合微生態(tài)制劑要優(yōu)于單一菌種的微生態(tài)制劑。主要原因可能是復合微生態(tài)制劑含有多種菌株，在日本醫(yī)蛭體內產生的維生素和氨基酸含量相對較高，提供的營養(yǎng)較為豐富，同時復合微生態(tài)制劑對日本醫(yī)蛭腸道內的蛋白酶和消化酶活性的促進作用優(yōu)于單一菌種的微生態(tài)制劑，提高了日本醫(yī)蛭對餌料的利用與轉化，從而促進日本醫(yī)蛭快速生長。

總之，在日本醫(yī)蛭的人工養(yǎng)殖過程中適當?shù)募尤爰S腸球菌和丁酸梭菌，可以降低日本醫(yī)蛭的病死率，提高日本醫(yī)蛭的產量，該文的研究能為日本醫(yī)蛭的大規(guī)模人工養(yǎng)殖提供一定的科學依據(jù)。