萬夢(mèng)弟，尤艷

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001）

惡性黑色素瘤（Malignant melanoma，MM）簡(jiǎn)稱惡黑，是來源于黑色素細(xì)胞、惡性度極高的疾病，其五年生存率從Ⅰ期的95%降至Ⅳ期的不足10%[1]。惡黑已成為皮膚癌致死疾病的首位，其中浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要因素。目前研究表明，MM發(fā)病有多因素、多步驟、逐步變化的特征：由正常上皮黑色素細(xì)胞增殖，繼而向真皮層侵襲，最后發(fā)展為MM，其中分子水平的變化是關(guān)鍵[2]研究顯示基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[3]，MMP-2與MMP-9是MMP家族中的重要成員，對(duì)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用。因此，本研究應(yīng)用免疫組化方法觀察MM組織中MMP-2和MMP-9的表達(dá)情況以及結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其陽(yáng)性表達(dá)與患者生存期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 52例MM患者（試驗(yàn)組）、20例色素痣患者（對(duì)照組）標(biāo)本均來自于2010～2015年哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科確診的石蠟包埋組織塊，全部病例術(shù)前均未采取放、化療等任何干預(yù)措施，且全部經(jīng)過皮膚科2位病理醫(yī)師共同確認(rèn)，所有病例從術(shù)后隨訪至2018年9月1日記錄其生存期，期間患者死亡隨訪停止，收集52例MM患者的生存時(shí)間、生存結(jié)局及影響因素（性別、年齡、MMP-2、MMP-9）。試驗(yàn)組其中男 29 例，女 23 例，年齡25～78歲，平均58歲；對(duì)照組男8例，女12例，年齡21～76歲，平均52歲。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人MMP-2、MMP-9單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司，SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中山生物公司，石蠟切片機(jī)為上海美盛生產(chǎn)的LEICA RM 2125，攝影顯微鏡為日本光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟 免疫組化SP法檢測(cè)MMP-2、MMP-9。實(shí)驗(yàn)步驟：石蠟切片脫蠟至水，切片放入緩沖液中微波爐加熱15 min進(jìn)行抗原熱修復(fù)，加3%H2O2孵育20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，分別滴加 MMP-2、MMP-9 一抗工作液（工作濃度 1∶100）4℃冰箱過夜，然后按說明書進(jìn)行DAB顯色，顯微鏡下雙蒸水終止顯色，蘇木素復(fù)染3 min，梯度酒精脫水后樹膠封片，上鏡讀片。

1.4 結(jié)果判斷 MMP-2和MMP-9表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡（40×）視野閱片，采用免疫反應(yīng)積分法（Immuno-reactive score，IRS）[4]進(jìn)行綜合判斷，IRS=陽(yáng)性細(xì)胞百分比積分×陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度積分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比積分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)顯微鏡下陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比積分，未著色0分，1%～10%為 1分，11%～25為 2分，26%～50%為 3分，＞50%為4分；陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。IRS＞4為陽(yáng)性，≤4為陰性。所有結(jié)果都由2位皮膚病理醫(yī)師雙盲閱片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。MMP-2和MMP-9在MM與色素痣中表達(dá)差異采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；性別、年齡、MMP-2和MMP-9在MM表達(dá)與預(yù)后關(guān)系采用多變量Cox回歸分析，校正性別、年齡因素后應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制MMP-2與MMP-9生存率曲線，之間的差異應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1A MMP-2在MM組織中的表達(dá)

2 結(jié)果

2.1 MMP-2、MMP-9在MM、色素痣中的表達(dá) MMP-2在MM組織中陽(yáng)性表達(dá)率為80.8%（42/52），色素痣為 10%（2/20），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=30.440，P＜0.01），見表 1，圖 1A；MMP-9 在 MM 組織中陽(yáng)性表達(dá)率為 76.9%（40/52），色素痣為 15%（3/20），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.025，P＜0.01），見表 1，圖1B。

2.2 MMP-2和MMP-9在MM中表達(dá)率的差異性 MM中組織中MMP-2和MMP-9雙陽(yáng)性表達(dá)為34例，雙陰性為4例，配對(duì)四格表資料比較二者在MM中的表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.07，P＞0.05），見表2。

2.3 將性別、年齡、MMP-2、MMP-9進(jìn)行多變量Cox回歸分析，結(jié)果顯示只進(jìn)行了MMP-2和MMP-9兩步回歸，說明年齡和性別與MM生存時(shí)間無明顯相關(guān)性；MMP-2（B=1.879）、MMP-9（B=1.489）陽(yáng)性二者的回歸系數(shù) B＞0，MMP-2（HR=6.546，95%置信區(qū)間為 1.543～27.774）、MMP-9（HR=4.434，95%置信區(qū)間為1.623～12.114）蛋白陽(yáng)性二者的風(fēng)險(xiǎn)比HR＞1，說明二者是威脅MM患者死亡的危險(xiǎn)因素；在MMP-9表達(dá)相同的情況下，MMP-2表達(dá)會(huì)使MM患者死亡率提高6.564倍；在MMP-9表達(dá)相同的情況下，MMP-2表達(dá)會(huì)使MM患者死亡率提高4.434倍，見表3。

表1 MMP-2、MMP-9在MM及色素痣組織中的表達(dá)情況

圖1B MMP-9在MM組織中的表達(dá)

表2 MMP-2和MMP-9在MM中表達(dá)的差異 例

表3 MMP-2、MMP-9與MM患者預(yù)后的多變量Cox回歸分析

2.4 單因素Kaplan-Meier法分析顯示MMP-2陽(yáng)性表達(dá)的MM患者的生存期顯著低于陰性者（均P=0.004），生存曲線如圖 2A；同樣，MMP-9 陽(yáng)性表達(dá)的MM患者的生存期也顯著低于陰性者（均P＜0.001），生存曲線如圖 2B。

3 討論

MMP-2和MMP-9是2個(gè)重要的金屬蛋白酶超家族成員，參與廣泛的蛋白水解事件，包括腫瘤生長(zhǎng)，遷移，轉(zhuǎn)移和血管生成。You等[5]研究顯示MMP通過降解細(xì)胞外基質(zhì)從而促進(jìn)MM細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究顯示，在MM組中MMP-2表達(dá)率（80.8%）、MMP-9表達(dá)率（76.9%）均明顯高于色素痣組（P＜0.01），提示二者在MM病情發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，這與國(guó)內(nèi)萬慧穎等[6]研究報(bào)道相一致。但導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶高表達(dá)的原因尚無明確報(bào)道。國(guó)外Preisner等[7]的體外研究表明來源于人類脂肪組織的干細(xì)胞可使MMP尤其是MMP-2的表達(dá)水平增加，但真正在MM患者體內(nèi)有怎樣的分子生物學(xué)變化，現(xiàn)在還不得而知。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MMP-2和MMP-9雙陽(yáng)性表達(dá)的病例數(shù)高達(dá)30例（50.69%），應(yīng)用配對(duì)四格表資料的χ2檢驗(yàn)分析其二者在MM中表達(dá)的陽(yáng)性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這不能排除二者之間表達(dá)是否有相關(guān)性。Jiang等[8]的研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞通過FAK/Akt/ERK和NF-κB信號(hào)通路下調(diào)MMP-2/-9的表達(dá)。但文獻(xiàn)尚無報(bào)道二者在基因及分子水平表達(dá)過程中是否有交叉。此外，本研究應(yīng)用多因素逐步Cox相關(guān)分析，排除年齡及性別因素后，發(fā)現(xiàn)MMP-2與MMP-9是影響MM患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而且在MMP-9表達(dá)相同的情況下，MMP-2表達(dá)會(huì)使MM患者死亡率提高6.564倍；在MMP-9表達(dá)相同的情況下，MMP-2表達(dá)會(huì)使MM患者死亡率提高4.434倍。而且單因素分析顯示，MMP-2與MMP-9陽(yáng)性表達(dá)患者的生存期明顯短于陰性者，其表達(dá)顯著增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，提示MM患者M(jìn)MP-2和MMP-9的表達(dá)水平在評(píng)估患者預(yù)后中可能有潛在價(jià)值，有望成為臨床醫(yī)師評(píng)估患者預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究樣本量偏小，今后需要更大的數(shù)據(jù)去驗(yàn)證本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。另一方面，病例資料全部來源于黑龍江省，因MM發(fā)病有遺傳因素[9]，所以本實(shí)驗(yàn)研究不能排除基因易感性造成的偏倚，而且變量較少，應(yīng)收集更多資料，多因素分析，從而增強(qiáng)預(yù)后評(píng)估的準(zhǔn)確性。

圖2 MMP-2、MMP-9生存率曲線

通過本次研究，筆者發(fā)現(xiàn)MMP-2及MMP-9在MM組織中高表達(dá)，且二者是影響MM患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Ahmad等[10]研究報(bào)道了腎癌患者M(jìn)MP-2、MMP-9血清學(xué)的變化可以用作早期疾病診斷的生物標(biāo)志物，也可用于監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)。所以下一步計(jì)劃應(yīng)用前瞻性研究，收集MM以及色素痣患者術(shù)前、術(shù)后MMP-2、MMP-9血清學(xué)數(shù)據(jù)，分析其用作早期疾病診斷以及監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的可行性；繼續(xù)深入探究MMP高表達(dá)的原因及途徑有望為治療MM提供新的思路及靶點(diǎn)。