金軼 ，陳斌 ，丁帆 ，成仙葉 ，李謝倫 ，陳芳 ，蘇東明

（1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)，南京210029）

紫外線（Ultraviolet，UV）導(dǎo)致皮膚損傷的機制十分復(fù)雜，大量研究表明氧化應(yīng)激是UV造成皮膚損傷的重要原因。UV可以干擾細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生過量活性氧簇（ROS），一旦ROS生成量超過機體抗氧化系統(tǒng)的清除能力時，即激活細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[1]。核因子E2相關(guān)因子（Nrf）2已被證實是一種調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化平衡的關(guān)鍵因子，激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化損傷通路可以維持皮膚正常的屏障功能，從而保護(hù)皮膚細(xì)胞免受UV誘導(dǎo)的損傷[2]。當(dāng)UV照射激活細(xì)胞氧化應(yīng)激后，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生紊亂，錯誤折疊蛋白增多，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress），為了應(yīng)對 ER stress，哺乳動物細(xì)胞內(nèi)會激活一系列信號通路，稱為未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），包括暫時停止早期蛋白質(zhì)的合成和誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白的降解（ERAD）等，羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白（Hrd）1是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種E3泛素連接酶，又稱為滑膜素（Synoviolin），其在識別、轉(zhuǎn)運和泛素化折疊錯誤的蛋白的過程中起著重要作用。多種研究表明Hrd1與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[3]、阿爾茨海默病[3]、肝臟纖維化[5]、腎纖維化[6]、帕金森病[7]、癌癥[8]等的發(fā)生有關(guān)。Wu等[5]的研究證實Hrd1是Nrf2的特異性E3泛素連1接酶，Hrd1的C端通過與Nrf2的Neh4-5區(qū)域相結(jié)合，對Nrf2進(jìn)行泛素化，然后蛋白酶體識別并進(jìn)一步降解Nrf2，加重細(xì)胞氧化損傷。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，紫外線照射可明顯促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞中Hrd1的表達(dá)，但Hrd1與Nrf2在人皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)是否存在關(guān)聯(lián)，目前仍缺乏相關(guān)研究[9-10]。本實驗通過收集臨床標(biāo)本及體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步探討UV照射與成纖維細(xì)胞中Hrd1、Nrf2表達(dá)水平的關(guān)系，以及Hrd1與Nrf2之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Hrd1一抗（兔抗人多克隆抗體，美國Abcam公司）、Nrf2一抗（兔抗人單克隆抗體美國abcam公司）、β-actin一抗（CST公司）、羊抗兔二抗（美國Thermo公司）、熒光抗兔二抗（美國Thermo公司），熒光抗羊二抗（美國Thermo公司），PV-6000試劑盒（北京中杉金橋有限公司）；Lipofetamine 2000（美國 Thermo公司）；protein a/G agarose beads（美國Thermo公司）；臺式紫外線輻射儀（美國Sigma公司）；LSM 700激光共聚焦掃描顯微鏡（Zeiss AG）。

1.2 方法

1.2.1 臨床標(biāo)本收集 臨床皮膚標(biāo)本來自2018年12月—2019年6月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科患者淺表良性腫物病灶周圍正常皮膚，共12例，均為女性。曝光部位皮膚取自面頸部，避光部位皮膚取自胸背部、大腿及臀部。根據(jù)部位將標(biāo)本分為2組，每組6份，組1來自避光部位，平均年齡（40.30±10.19）歲，組2來自曝光部位，平均年齡（40.10±10.31）歲。本研究通過南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2016-SRFA-033）。

1.2.2 免疫組化檢測人皮膚中Hrd1和Nrf2表達(dá) 人皮膚組織用10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫蠟，并進(jìn)行抗原修復(fù)，然后滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，常溫孵育，一抗4℃孵育過夜（Hrd1濃度為1∶150，Nrf2 濃度為 1∶200），滴加酶標(biāo)羊抗兔 IgG 聚合物，37℃孵育；二氨基聯(lián)苯胺染色液顯色，然后復(fù)染、脫水、透明、封片。使用DP2-BSW采集圖片，用Image J軟件對圖片進(jìn)行半定量分析，計算平均光密度值（平均光密度值=IOD值/面積）。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取包皮環(huán)切手術(shù)患者的包皮標(biāo)本，分離培養(yǎng)原代人成纖維細(xì)胞，方法參照文獻(xiàn)[10]。人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。選用4～8代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.4 細(xì)胞照光 細(xì)胞分為對照組、長波紫外線（UVA）組、中波紫外線（UVB）組。UVA組和UVB組照光前用磷酸鹽緩沖液（PBS）覆蓋細(xì)胞上層，照射劑量為10 J/cm2UVA或30 mJ/cm2UVB。UVA組和UVB組（紫外線照射后）繼續(xù)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.5 細(xì)胞蛋白提取及Western blot法檢測細(xì)胞中Hrd1和Nrf2的表達(dá) 提取細(xì)胞蛋白：將體外培養(yǎng)的各組人皮膚成纖維細(xì)胞加入0.25%胰酶，于37℃孵育5 min，加入等量PBS后離心，棄上清，沉淀物加入裂解緩沖液（RIPA）中，靜置20 min后離心（4℃，12 000 轉(zhuǎn)/min，20 min），棄沉淀，取上清，根據(jù)蛋白濃度進(jìn)行配平，然后加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min后置于-20℃保存。

Western blot：將含有等量蛋白的樣品上樣后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，室溫下，用5%脫脂奶粉封閉非特異性蛋白1 h。加入一抗（Hrd1濃度為1∶200，Nrf2濃度為1∶1 000），4℃冰箱中過夜，次日洗滌緩沖液（TBST）洗 3次，15 min/次，加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下結(jié)合1.5 h，再用TBST洗3次。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)5 min，利用凝膠自動成像儀成像。采用Image J軟件進(jìn)行半定量分析，數(shù)據(jù)表達(dá)為Hrd1和Nrf2蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。

1.2.6 細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染 人靶向Hrd1基因的小干擾RNA（siRNA）由廣州銳博生物技術(shù)有限公司的專業(yè)軟件設(shè)計，si-Hrd1-1序列為5'-CCAUGAGGCAGUUCAAGAAdTdT-3'，si-Hrd1-2 序列為5'-UGUCUGGCCUUCACCGUUU-3’。轉(zhuǎn)染前取處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長至60%～70%匯合后，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5～6 h，更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用于后續(xù)實驗研究。

1.2.7 免疫熒光 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至激光共聚焦專用培養(yǎng)板內(nèi)，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出，PBS中洗3次，多聚甲醛固定30 min（室溫），再用1%Triton-X 100在室溫通透15～30 min后，加入二抗同源血清封閉 1 h，滴加一抗（Hrd1 濃度為 1∶50；Nrf2 濃度為1∶100）室溫孵育 1 h，PBST 洗 3 次后，滴加熒光二抗避光孵育45 min，封片，使用LSM700共聚焦激光掃描顯微鏡（Zeiss AG）進(jìn)行圖像采集。

1.2.8 免疫共沉淀 細(xì)胞裂解物中分別加入Hrd1抗體、Nrf2抗體、對照IgG抗體，孵育1 h，隨后加入ProteinA/G瓊脂糖珠，4℃過夜，次日離心（4℃，14 000轉(zhuǎn)/min，1 min），棄上清，用裂解緩沖液洗 3次后加入1×SDS上樣緩沖液重新懸浮，95℃水浴5 min，后續(xù)進(jìn)行 Western blot，檢測 Hrd1和 Nrf2的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hrd1和Nrf2在人體皮膚中的表達(dá) 首先，筆者應(yīng)用免疫組化法檢測Hrd1及Nrf2在不同部位人皮膚組織中的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，不同部位人皮膚標(biāo)本中，均可發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞Hrd1及Nrf2的表達(dá)，曝光部位皮膚組織中Hrd1表達(dá)（0.4756±0.0785）明顯高于避光部位（0.1270±0.0253，t=7.317，P＜0.05），曝光部位皮膚組織中Nrf2表達(dá)（0.119 0±0.021 7）明顯低于避光部位（0.262 9±0.026 3，t=7.306，P＜0.05），提示紫外線照射可以增加皮膚組織中Hrd1的表達(dá)，并且抑制Nrf2的表達(dá)。

2.2 UV照射對體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞中Hrd1和Nrf2表達(dá)的影響 筆者進(jìn)一步在體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞中驗證了上述結(jié)果，將體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞分為3組，分別為對照組、UVA組、UVB組，Western blot結(jié)果如圖2顯示：對照組、UVA組、UVB組的Hrd1蛋白水平分別是0.505 9±0.108 3、1.186 0±0.121 8、0.886 3±0.192 7，差異有統(tǒng)計學(xué)意（F=16.42，P＜0.05）；對照組、UVA 組、UVB組的Nrf2蛋白水平分別是1.174 0±0.064 7、0.401 8±0.196 9、0.395 3±0.076 1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=37.05，P＜0.05）。UVA 組與對照組相比，Hrd1蛋白表達(dá)水平明顯增高（t=7.227，P＜0.05），Nrf2 蛋白表達(dá)水平明顯下降（t=6.456，P＜0.05）；UVB 組與對照組相比，Hrd1蛋白表達(dá)水平明顯增高（t=2.980，P＜0.05），Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯下降（t=13.52，P＜0.05）。

2.3 在體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞中下調(diào)Hrd1的表達(dá)對Nrf2的影響 為了檢測Hrd1和Nrf2在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的關(guān)系，應(yīng)用Hrd1-SiRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)人纖維細(xì)胞后，用Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Hrd1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，Si-Hrd1-1組與Si-Hrd1-2組的Hrd1蛋白表達(dá)均明顯下降（均P＜0.05）見圖3A，表示Hrd1-SiRNA轉(zhuǎn)染有效。

無論是經(jīng)UVA照射還是UVB照射，照射后UV組細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá)較對照組下降（UVA照射和 UVB 照射的 t值分別為 13.37、13.67，均 P＜0.05），UV+Si-control組細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá)較對照組下降（t分別為 12.38、9.403，均 P＜0.05），UV+Si-Hrd1-1組細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá)較UV組明顯升高（t分別為9.263、17.76，均 P＜0.05），UV+Si-Hrd1-2 組細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá)較UV組明顯升高（t分別為25.77、25.84，均 P＜0.05）見圖 3B。

2.4 免疫熒光分析 綠色熒光染色的是Hrd1蛋白分子，紅色熒光染色的是Nrf2蛋白分子，二者結(jié)合后有橙色熒光出現(xiàn)，表明Hrd1與Nrf2二者在細(xì)胞內(nèi)存在共定位。

2.5 免疫共沉淀 Input為等量的總蛋白；IP-IgG為陰性對照免疫共沉淀；A.IP-Nrf2為Nrf2抗體免疫共沉淀所得蛋白，B.IP-Hrd1為Hrd1抗體免疫共沉淀所得蛋白。

筆者進(jìn)一步應(yīng)用免疫共沉淀明確Hrd1與Nrf2在體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞中是否存在內(nèi)源性結(jié)合，結(jié)果表明，無論用Nrf2一抗還是Hrd1一抗與體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀，均可證明Hrd1與Nrf2在細(xì)胞內(nèi)存在內(nèi)源性結(jié)合。

3 討論

長期UV照射導(dǎo)致皮膚損傷機制十分復(fù)雜，大量研究表明氧化應(yīng)激是UV造成皮膚損傷的重要原因[11]。Nrf2是一種調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，以轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方式對抗皮膚細(xì)胞的氧化應(yīng)激[12]，正常情況下，Nrf2由細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白Keap1調(diào)控，Nrf2和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白Keap1以N端的Neh2區(qū)域結(jié)合成二聚體的形式存在于細(xì)胞漿中，從而使保護(hù)細(xì)胞的酶類和抗氧化物處于基礎(chǔ)表達(dá)水平，維持細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)[13]，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激后，Nrf2可與Keap1分離并被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)原件（Antioxidant response elemen，ARE）結(jié)合，啟動Nrf2下游一系列抗氧化酶的合成和表達(dá)[14]。Nrf2/ARE信號通路的激活可以保護(hù)細(xì)胞和組織免受氧化應(yīng)激的損傷，在UV致皮膚氧化應(yīng)激的過程中起保護(hù)作用[2]。

圖1 免疫組化法檢測人皮膚組織中Hrd1的表達(dá)

圖2 Western印跡法檢測紫外線照射對人成纖維細(xì)胞中Hrd1和Nrf2表達(dá)的影響

圖3 Western blot法檢測人成纖維細(xì)胞中下調(diào)Hrd1表達(dá)對Nrf2表達(dá)的影響

圖4 免疫熒光分析法檢測人成纖維細(xì)胞中Hrd1和Nrf2的共定位情況

圖5 免疫共沉淀法檢測Hrd1與Nrf2在人成纖維細(xì)胞中是否存在內(nèi)源性結(jié)合

激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化損傷通路已被證明可以維持皮膚正常的屏障功能，從而保護(hù)皮膚細(xì)胞免受UV誘導(dǎo)的損傷。有研究顯示，在同樣UV照射的情況下，Nrf2基因敲除的小鼠與未敲除小鼠相比，前者明顯出現(xiàn)了更強烈的日曬傷和細(xì)胞氧化損傷[15]。Nrf2激活劑在防止皮膚光老化中應(yīng)用廣泛，Nrf2激活劑通過激活Nrf2依賴的基因表達(dá)，在應(yīng)激條件下對皮膚起到保護(hù)作用。Patwardhan等[16]研究秋葵提取物對光老化的防護(hù)作用及作用機制時發(fā)現(xiàn)，秋葵提取物可通過激活Nrf2通路增加其下游蛋白的表達(dá)，使其發(fā)揮下調(diào)活性氧簇水平和保持細(xì)胞內(nèi)抗氧化物水平的作用，從而減少UVB照射引起的皮膚成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激。

Hrd1作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途經(jīng)（ERAD）相關(guān)E3酶中的一種，在識別、轉(zhuǎn)運和泛素化折疊錯誤的蛋白的過程中起著重要的作用。在正常生理情況下，Hrd1介導(dǎo)的ERAD可以降解發(fā)生錯誤折疊的蛋白，實現(xiàn)蛋白質(zhì)量控制的目的。在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的感受器IRE1介導(dǎo)的通路可以通過上調(diào)Hrd1的表達(dá)來清除錯誤折疊蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞存活[17]。在筆者的前期研究中，筆者已發(fā)現(xiàn)UV照射不論在體外還是體內(nèi)都可以顯著提高皮膚成纖維細(xì)胞中Hrd1的表達(dá)。

為進(jìn)一步探究Hrd1與Nrf2之間的關(guān)系，本次實驗中，筆者收集12例臨床標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)曝光部位Hrd1的表達(dá)水平明顯高于避光部位，且曝光部位人皮膚的Nrf2的表達(dá)水平明顯低于避光部位，說明長期進(jìn)行UV照射會引起皮膚中Hrd1的表達(dá)升高以及Nrf2的表達(dá)下降。同時，筆者在體外培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞中進(jìn)一步驗證了上述結(jié)果，無論是UVA還是UVB照射后，與對照組相比，成纖維細(xì)胞中Hrd1的表達(dá)水平增高，Nrf2的表達(dá)水平下降，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

有研究顯示Hrd1是Nrf2的特異性E3泛素連接酶[5，18-19]，Hrd1以Nrf2的Neh4-5結(jié)構(gòu)域為靶點，在氧化應(yīng)激條件下，Hrd1將Nrf2泛素化和降解，加重細(xì)胞的氧化損傷。本次實研究中，筆者利用Hrd1-SiRNA下調(diào)成纖維細(xì)胞中Hrd1的表達(dá)后，可觀察到UV照射引起的Nrf2表達(dá)下降可以被逆轉(zhuǎn)，Nrf2表達(dá)水平回升。筆者進(jìn)一步應(yīng)用免疫熒光分析和免疫共沉淀實驗來明確Hrd1與Nrf2在細(xì)胞內(nèi)定位和結(jié)合情況，免疫熒光分析結(jié)果顯示Hrd1和Nrf2在成纖維細(xì)胞中均有表達(dá)，Hrd1與Nrf2共定位呈現(xiàn)橙色熒光，表明Hrd1與Nrf2在細(xì)胞內(nèi)存在共定位和結(jié)合，免疫共沉淀結(jié)果同樣也提示Hrd1與Nrf2存在內(nèi)源性結(jié)合，這一結(jié)果與Wu等[5]的結(jié)果一致，表明Nrf2是Hrd1的特異性結(jié)合底物。

綜上，本研究證實了UV照射不論在體內(nèi)還是體外都可以顯著提高人皮膚成纖維細(xì)胞中Hrd1表達(dá)，并抑制Nrf2在人皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且Hrd1與Nrf2存在共定位和內(nèi)源性結(jié)合，抑制Hrd1的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)UV照射引起的Nrf2表達(dá)下降，提示UV照射可通過增加皮膚細(xì)胞中Hrd1的表達(dá)從而抑制Nrf2的表達(dá)，其機制可能與增高的Hrd1加大了對其特異性底物Nrf2的泛素化降解有關(guān)，對此筆者還需要進(jìn)一步的深入研究。