程 遠,向 森,路慧彬

1)駐馬店市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 河南駐馬店 463000 2)駐馬店市中心醫(yī)院腫瘤一科 河南駐馬店 463000 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院介入科 鄭州 450052

甲狀腺癌發(fā)病率與地區(qū)、種族、性別有一定關(guān)系;女性發(fā)病較多，男女發(fā)病比例為1∶(2～4);任何年齡均可發(fā)病，但以青壯年多見[1-2]。Pentraxin 3(PTX3)是一種進化保守的模式識別分子，是先天免疫的重要組成部分[3],其表達受多種信號通路的調(diào)控，如NF-κB、JNK和PI3K/Akt信號通路[4]。PTX3參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展，已被視為一種反映癌癥進展的標(biāo)志[5-6]。然而，目前對PTX3在甲狀腺癌中的作用尚未形成定論。TLR4/NF-κB信號通路是主要的炎癥途徑之一。Toll樣受體(TLR)是一類天然免疫受體，其適度表達維持了機體的防御功能，在抵抗和清除病原微生物、維持機體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定狀態(tài)方面具有重要意義[7-8]。TLR4的激活可誘導(dǎo)促炎因子的生成，從而引發(fā)自身免疫性疾病或炎癥性疾病[9]。NF-κB能夠調(diào)節(jié)自身免疫性疾病、慢性炎癥和多種惡性腫瘤的疾病過程[10-11]。本探究利用si-PTX3干擾甲狀腺癌細胞TPC-1中PTX3的表達，觀察TPC-1細胞增殖、侵襲能力，以及炎癥因子IL-6、NO和TNF-α水平的變化，探討PTX3與甲狀腺癌的關(guān)系，為甲狀腺癌的診斷和治療提供新思路。

1 對象與方法

1.1甲狀腺癌組織中PTX3表達的檢測

1.1.1 標(biāo)本來源 收集2015年6月至2018年12月我院收治的甲狀腺乳頭狀腺癌患者32例，留取患者腫瘤組織標(biāo)本及距離腫瘤組織3～6 cm的癌旁正常組織(均經(jīng)病理證實)。

1.1.2 組織中PTX3 mRNA的檢測 采用實時熒光定量PCR檢測組織中PTX3 mRNA表達水平。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。PTX3正向引物序列 5’-CAT TCTCACTCGACACACGAT-3’，反向5’-GCCGAG GCGTTGACCTAGAGC-3’。內(nèi)參GAPDH正向引物序列5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。細胞裂解液購自陜西科源生物科技有限公司。將待測組織研磨成粉末狀，加入裂解液混合均勻，30 min后離心取上清；提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得cDNA；以cDNA為模板，進行熒光定量PCR。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算PTX3 mRNA表達水平。

1.1.3 組織中PTX3蛋白的檢測 采用Western blot法檢測組織中PTX3蛋白的表達。PTX3一抗、內(nèi)參GAPDH一抗、HRP標(biāo)記的二抗均購自北京索萊寶生物科技有限公司。將待測組織研磨成粉末狀，加入裂解液混合均勻，30 min后離心提取總蛋白，4 ℃12 000×g離心15 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加50 g/L脫脂奶粉封閉液3 mL室溫條件下于搖床上封閉1 h，TBST溶液清洗膜10 min×3次；加入一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜，回收一抗；TBST洗膜10 min×3次；加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜10 min×3次。最后，取適量發(fā)光液(A和B液等體積混勻)孵育膜3 min，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光，用Quantity-One軟件分析蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值。

1.2TPC-1細胞來源及分組甲狀腺癌細胞TPC-1來源于中國科學(xué)院細胞庫；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自北京索萊寶生物科技有限公司。將TPC-1細胞用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)達到60%～70%融合時用2.5 g/L胰酶消化處理，以1∶3的比例進行傳代。將TPC-1細胞以1×105個/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，細胞約鋪滿培養(yǎng)板70%時，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。然后分3組處理，si-PTX3組和si-NC組脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染si-PTX3或?qū)φ誷i-NC(北京擎科生物科技有限公司)，空白對照組不轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體來源于北京索萊寶生物科技有限公司。37 ℃培養(yǎng)4～6 h后，將無血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。利用實時熒光定量PCR和Western blot法檢測3組細胞中PTX3 mRNA和蛋白表達水平(方法同前)，以判定si-PTX3的干擾效率。

1.33組TPC-1細胞凋亡的檢測收集3組細胞，離心并重懸于結(jié)合緩沖液中，加入5 μL的Annexin V-FITC輕輕吹打混勻，再加入5 μL的PI輕輕吹打混勻，室溫下暗中溫育5～15 min，然后使用FACSCalibur流式細胞儀進行分析。實驗重復(fù)3次。Annexin V-FITC/PI試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.43組TPC-1細胞增殖的檢測將3組細胞以1×105個/孔的密度接種在96孔板中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；BRDU法檢測細胞增殖，按試劑說明操作。試劑來源于北京索萊寶生物科技有限公司。細胞增殖率=(1-實驗組細胞數(shù)/空白對照組細胞數(shù))×100%。

1.53組TPC-1細胞侵襲能力的檢測將3組細胞以1×105個/孔接種于6孔板中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；消化、離心，用無血清培養(yǎng)基稀釋成2×104個/mL的細胞懸液。按照200 μL/孔將細胞懸液加入Transwell小室上室，同時在下室加入10%TBS和500 μL培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后取出小室，吸去上室中的液體，用PBS清洗3次，用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動，吸干水分并擦去膜內(nèi)側(cè)的細胞；在上室中加入結(jié)晶紫染液，5 min后回收染液，用流水緩緩沖洗，再次用棉棒吸干水分；于正置顯微鏡下拍照；在100倍視野下計數(shù)3個視野的侵襲細胞數(shù)。細胞侵襲率=(1-實驗組細胞數(shù)/空白對照組細胞數(shù))×100%。

1.63組細胞中Caspase-3、MMP-1、磷酸化TLR4(p-TLR4)、p-P65和 NF-κB 蛋白的檢測收集3組細胞，采用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，侵襲相關(guān)蛋白MMP-1，以及TLR4/NF-κB信號通路蛋白p-TLR4、p-P65和NF-κB的表達情況，以GAPDH為內(nèi)參，具體操作同前。抗體均購自北京索萊寶生物科技有限公司。Caspase-3、p-TLR4、p-P65一抗稀釋度為1∶1 000，MMP-1和NF-κB一抗稀釋度為1∶800。

1.73組細胞中IL-6、NO和TNF-α水平的檢測收集3組細胞，按照ELISA試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)指導(dǎo)說明操作，檢測細胞中IL-6、NO和TNF-α水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行分析。甲狀腺癌和癌旁正常組織中PTX3 mRNA和蛋白表達水平的比較采用配對t檢驗；2組細胞增殖率、侵襲率的比較采用兩獨立樣本t檢驗；3組細胞凋亡率，Caspase-3、MMP-1、p-TLR4、p-P65和NF-κB蛋白表達水平及細胞中IL-6、NO和TNF-α水平的比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1甲狀腺癌組織中PTX3的表達甲狀腺癌組織中PTX3 mRNA和蛋白的表達水平均高于癌旁正常組織，見表1。

2.23組TPC-1細胞中PTX3mRNA和蛋白表達水平的比較見表2。si-PTX3組細胞中PTX3 mRNA和蛋白表達水平低于空白對照組和si-NC組，提示si-PTX3可成功干擾TPC-1細胞中PTX3的表達。

表1 甲狀腺癌和癌旁正常組織中PTX3 mRNA和蛋白表達水平的比較

表2 3組TPC-1細胞中PTX3 mRNA和蛋白表達水平的比較

*：與空白對照組和si-NC組比較，P<0.05

2.33組TPC-1細胞增殖、凋亡和侵襲能力的比較見圖1、表3和圖2、表4。與空白對照組或si-NC組相比，si-PTX3組細胞增殖率和侵襲率降低，凋亡率升高(P<0.05)；細胞凋亡蛋白Caspase-3表達升高，而侵襲相關(guān)蛋白MMP-1表達降低(P<0.05)。

圖1 3組TPC-1細胞BRDU染色(上)和侵襲實驗(下)結(jié)果

組別n增殖率/%凋亡率/%侵襲率/%空白對照組3-5.0±0.2-si-NC組355±44.5±0.148±2si-PTX3組322±215.0±1.0*25±1t/F344.850300.7101 037.400P<0.001<0.001<0.001

*：與空白對照組和si-NC組比較，P<0.05

圖2 3組TPC-1細胞中Caspase-3和MMP-1蛋白的表達

組別nCaspase-3 MMP-1空白對照組30.58±0.060.55±0.05si-NC組30.62±0.070.59±0.06si-PTX3組31.98±0.15*0.21±0.05*F184.41045.630P<0.001<0.001

*：與空白對照組和si-NC組比較，P<0.05

2.43組TPC-1細胞中TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達的比較見圖3和表5。si-PTX3組細胞中p-TLR4和p-P65表達水平低于空白對照組和si-NC組；3組NF-κB蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.53組TPC-1細胞中促炎細胞因子水平的比較si-PTX3組細胞中IL-6、NO和TNF-α水平較空白對照組和si-NC組降低，見表6。

圖3 3組TPC-1細胞中TLR4/NF-κB信號通路蛋白的表達

表5 3組TPC-1細胞中TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達的比較

*：與空白對照組和si-NC組比較，P<0.05

表6 3組TPC-1細胞中促炎細胞因子水平的比較

*：與空白對照組和si-RNA組比較，P<0.05

3 討論

甲狀腺癌約占全身惡性腫瘤的1%；除髓樣癌外，絕大部分甲狀腺癌起源于濾泡上皮細胞[12]。研究[5-6，13-15]發(fā)現(xiàn)，PTX3參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程，其在肺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤和乳腺癌等多種腫瘤組織中表達均顯著增加，與腫瘤的分化程度相關(guān)。PTX3也是炎癥反應(yīng)的效應(yīng)因子，在炎癥條件下可以激活效應(yīng)器，是先天免疫的重要組成[7]。因此，PTX3可能是腫瘤相關(guān)炎癥和惡性腫瘤的標(biāo)志物[16]。TLR4是一種天然免疫受體。近年來，TLR4/NF-κB信號通路在腫瘤炎癥反應(yīng)中的作用逐漸引起人們的重視。Tang等[17]報道，沉默PCSK9可以抑制TLR4/NF-κB信號通路，進而抑制炎癥因子的水平，從而抑制胃癌的進展。Yan等[18]報道，miR-223可以抑制TLR4/NF-κB信號通路，進而抑制肺癌細胞的增殖活性和遷移能力，抑制肺癌的進一步惡化。

本研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌組織中PTX3 mRNA和蛋白表達水平均高于癌旁正常組織。干擾PTX3可抑制甲狀腺癌細胞TPC-1的增殖活性和侵襲能力，促進細胞凋亡。進一步的研究結(jié)果表明si-PTX3可顯著抑制TPC-1細胞中TLR4/NF-κB信號通路蛋白的表達及炎癥因子水平。以上結(jié)果表明PTX3可能通過激活TLR4/NF-κB信號通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)；促進甲狀腺癌細胞TPC-1的增殖活性和侵襲能力，抑制其凋亡。

綜上所述，本研究證明PTX3可能通過激活TLR4/NF-κB信號通路，促進甲狀腺癌細胞TPC-1的增殖和侵襲，PTX3有可能成為狀腺癌治療的新靶點。