李鳳寧，徐桂云，張俊楠，王喜瓊，李 毅，韋鳳英

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.廣西畜牧研究所，廣西南寧 530001；3.廣西鴻光農(nóng)牧有限公司，廣西玉林，537500）

隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)于食品品質(zhì)的要求也越來越高。在此背景之下，雞蛋僅定位于營養(yǎng)層面已無法滿足消費(fèi)者對(duì)其風(fēng)味和蛋品質(zhì)量的追求。在市場(chǎng)導(dǎo)向作用下，我國蛋品產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)得到不斷優(yōu)化并逐漸呈現(xiàn)多樣性，品種結(jié)構(gòu)由單一向多元化轉(zhuǎn)變，優(yōu)質(zhì)蛋的消費(fèi)比例也在逐漸增加。

我國雞品種資源豐富，但是地方品種基本用于生產(chǎn)雞肉，在產(chǎn)蛋性能方面多數(shù)未經(jīng)過嚴(yán)格選育，產(chǎn)蛋率不高。根據(jù)消費(fèi)者對(duì)優(yōu)質(zhì)雞蛋的需求以及養(yǎng)殖者對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的要求，優(yōu)質(zhì)蛋雞產(chǎn)蛋性能的選育逐漸被重視。本研究擬選擇9 個(gè)與產(chǎn)蛋量、就巢性、開產(chǎn)日齡等性狀相關(guān)的候選基因，利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）的手段檢測(cè)上述基因的SNP位點(diǎn)在群體中的分布情況，并分析其與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)性，以確定可能影響產(chǎn)蛋性能的SNPs，為提高地方品種雞產(chǎn)蛋性能的分子標(biāo)記育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究以廣西畜牧研究所和廣西鴻光農(nóng)牧有限公司共同培育的廣西麻雞為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)產(chǎn)蛋記錄將雞群分為高產(chǎn)組和低產(chǎn)組（高產(chǎn)組母雞開產(chǎn)至300 日齡總產(chǎn)蛋數(shù)與低產(chǎn)組差異在20 個(gè)以上），并從2組雞中挑選400 只母雞（高低產(chǎn)各200 只），統(tǒng)計(jì)每只雞的開產(chǎn)體重（FEBW）、開產(chǎn)日齡（FED）、300 日齡產(chǎn)蛋數(shù)（300DEM）、300 日齡體重（300DBW）和瑕疵蛋個(gè)數(shù)（REM）。

在實(shí)驗(yàn)雞群300 日齡時(shí)連續(xù)3 d 采集雞蛋，每個(gè)個(gè)體至少收集1 個(gè)雞蛋（剔除破蛋、軟殼蛋和雙黃蛋），共收集到337 個(gè)個(gè)體共358 個(gè)雞蛋，測(cè)定內(nèi)部和外部蛋品質(zhì)性狀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SNPs 位點(diǎn)的挑選 以查閱文獻(xiàn)的方式在9 個(gè)候選基因上挑選出在各個(gè)地方品種上報(bào)道的與產(chǎn)蛋量、就巢性、開產(chǎn)日齡3 個(gè)性狀顯著相關(guān)的SNPs 位點(diǎn)共18 個(gè)（表1）。

1.2.2 血樣采集及DNA 提取 對(duì)高低產(chǎn)實(shí)驗(yàn)組共400只母雞進(jìn)行翅下靜脈采血，注入裝有2%EDTA 抗凝劑的離心管中，-20℃保存。使用血液基因組DNA 提取試劑盒（DP318）（Tiangen，天根）提取基因組DNA。

1.2.3 MALDI-TOF MS SNPs 位點(diǎn)分型 采用Sequenom公司的MassArrrayTMiPLEX 飛行時(shí)間質(zhì)譜基因分型平臺(tái)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。根據(jù)SNP 位點(diǎn)上下游的序列信息，使用Sequenom 公司的引物設(shè)計(jì)軟件Assay design 3.1 進(jìn)行單堿基擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)，并提交給生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成，引物序列如表2 所示。

表1 SNP 位點(diǎn)信息

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 對(duì)FEBW、FED、300DBW、REM、蛋重（AW）、蛋形指數(shù)（ESI）、蛋殼強(qiáng)度（ESS）、蛋白高度（AH）、蛋黃顏色（YC）、蛋殼厚度（EST）、蛋黃比例（YR）和蛋殼比例（ESR）等性狀值進(jìn)行排序，分別按照各個(gè)指標(biāo)選取數(shù)據(jù)兩尾100 只個(gè)體數(shù)據(jù)，建立兩尾實(shí)驗(yàn)群體。運(yùn)用 Haploview 4.1 軟件的Case-Control 模塊進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNPs 檢測(cè)和多態(tài)性分析結(jié)果 運(yùn)用MALDI-TOF MS對(duì)18 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè)，分型結(jié)果如圖1 所示。其中，共有12 個(gè)位點(diǎn)SNP_1、SNP_2、SNP_3、SNP_4、SNP_5、SNP_7、SNP_8、SNP_9、SNP_10、SNP_11、SNP_12、SNP_13、SNP_14 存在雜合子情況（A），位點(diǎn)SNP_15、SNP_16、SNP_17、SNP_18 僅有純合子的情況出現(xiàn)，不存在雜合子（B）。

2.2 各個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)與性狀關(guān)聯(lián)分析 18 個(gè)SNP 位點(diǎn)在產(chǎn)蛋性能性狀的兩尾樣本中基因頻率的差異結(jié)果如表3 所示，其中，300DEM 兩尾樣本中SNP_6 和SNP_14這2 個(gè)位點(diǎn)差異極顯著；SNP_5 位點(diǎn)在兩尾樣本中差異顯著。但是，將這3 個(gè)位點(diǎn)的P值進(jìn)行100 000 次重排檢驗(yàn)后，只有位點(diǎn)SNP_14 仍然顯著，其余位點(diǎn)均未達(dá)到顯著水平。說明SNP_5 和SNP_6 是假陽性顯著結(jié)果，可能是因?yàn)閮山M樣本量較少。而SNP_14 經(jīng)過重排檢驗(yàn)后仍處于顯著水平，說明其確實(shí)與300DEM 有一定的關(guān)聯(lián)性。

表2 SNP 位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

圖1 SNPs 位點(diǎn)散點(diǎn)圖

針對(duì)300DBW 性能指標(biāo)，在兩尾樣本中SNP_15和SNP_18 這2 個(gè)位點(diǎn)存在差異極顯著；SNP_14 位點(diǎn)差異顯著。但是，將這3 個(gè)位點(diǎn)的P值進(jìn)行100 000 次重排檢驗(yàn)后，這些位點(diǎn)在兩尾樣本中差異均未達(dá)到顯著水平。

FED 兩尾樣本中，SNP_12 位點(diǎn)在兩尾樣本中差異顯著。對(duì)該位點(diǎn)的P值進(jìn)行100 000 次重排檢驗(yàn)后，該位點(diǎn)在兩尾樣本中的差異未達(dá)到顯著水平。

FEBW 兩尾樣本中，SNP_1、SNP_3、SNP_7、SNP_14等4 個(gè)位點(diǎn)存在顯著差異。但是，將這4 個(gè)位點(diǎn)的P值進(jìn)行100 000 次重排檢驗(yàn)后，這些位點(diǎn)在兩尾樣本中差異均未達(dá)到顯著水平。

MEM 上，SNP_10 和SNP_14 這2 個(gè)位點(diǎn)在兩尾樣本中存在差異極顯著；SNP_1 位點(diǎn)和SNP_4 位點(diǎn)在兩尾樣本中差異顯著。將這4 個(gè)位點(diǎn)的P值進(jìn)行100 000 次重排檢驗(yàn)后，只有位點(diǎn)SNP_14 差異極顯著；其余位點(diǎn)均未達(dá)到顯著水平。

18 個(gè)SNP 位點(diǎn)在蛋品質(zhì)性狀兩尾樣本中基因頻率的差異結(jié)果如表4 所示。其中，EW 兩尾樣本中，SNP_6、SNP_11、SNP_13 這3 個(gè)位點(diǎn)存在極顯著差異。但是，將這3 個(gè)位點(diǎn)的P值進(jìn)行100 000 次重排檢驗(yàn)后，這些位點(diǎn)在兩尾樣本中差異均未達(dá)到顯著水平。

在YC 兩尾樣本中，SNP_15、SNP_18 這2 個(gè)位點(diǎn)存在極顯著差異；SNP_6 位點(diǎn)在兩尾樣本中差異顯著。但是，將這4 個(gè)位點(diǎn)的P值進(jìn)行100 000 次重排檢驗(yàn)后，這些位點(diǎn)在兩尾樣本中差異均未達(dá)到顯著水平。

AH 兩尾樣本中，SNP_6 位點(diǎn)差異顯著。對(duì)SNP_6位點(diǎn)的P值進(jìn)行100 000 次重排檢驗(yàn)后，該位點(diǎn)在兩尾樣本中的差異未達(dá)到顯著水平。

ESR 兩尾樣本中，SNP_1 位點(diǎn)存在顯著差異。對(duì)SNP_1 位點(diǎn)的P值進(jìn)行100 000 次重排檢驗(yàn)后，該位點(diǎn)在兩尾樣本中的差異未達(dá)到顯著水平。

ESS 兩尾樣本中，SNP_10 位點(diǎn)存在極顯著差異；SNP_6 位點(diǎn)在兩尾樣本中差異顯著。但是，將這2 個(gè)位點(diǎn)的P值進(jìn)行100 000 次重排檢驗(yàn)后，這些位點(diǎn)在兩尾樣本中差異均未達(dá)到顯著水平。

表3 各個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)蛋性能性狀關(guān)聯(lián)分析

表4 各個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)與蛋品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析

ESI 兩尾樣本中，SNP_2、SNP_17 等兩個(gè)位點(diǎn)差異顯著。但是，將這2 個(gè)位點(diǎn)的P值進(jìn)行100 000 次重排檢驗(yàn)后，這些位點(diǎn)在兩尾樣本中差異均未達(dá)到顯著水平。

3 討 論

在雞中，催乳素（Prolactin,PRL）參與多種特定生理過程的調(diào)節(jié)，如孵化行為的發(fā)生、性腺發(fā)育、排卵、滲透調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)；已有研究發(fā)現(xiàn)PRL 通過其受體（Prolactin receptor,PRLR）的介導(dǎo)影響雞就巢行為的發(fā)生從而間接影響產(chǎn)蛋性能[13-15]。本研究中PRL、PRLR基因與蛋重、濃蛋白高度、蛋殼強(qiáng)度、300 日齡總產(chǎn)蛋數(shù)、開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體重等性狀顯著或極顯著相關(guān)。李叢艷[16]研究發(fā)現(xiàn)，位于PRLR 上的SNP_2（A25670G）與300 日齡產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)，SNP_3 與開產(chǎn)日齡顯著相關(guān)，SNP4（A31900G）與就巢行為極顯著相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

Feng[17]研究表明，在GHR基因外顯子4 上游的內(nèi)含子區(qū)存在許多與白來航雞生產(chǎn)和生長性狀相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)，并且GHR基因的突變對(duì)雞的生長發(fā)育及腹脂沉積具有顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)GHR基因上的SNP_15（G13557508A）、SNP_18（G13558144A）與300 日齡體重顯著相關(guān)；此外，IGF-I基因上的SNP_3（T55320060A）與開產(chǎn)體重顯著相關(guān)。同時(shí)，GHR和IGF-1基因是生長軸GH-GHR-IGF-I 通路的核心基因，因此推測(cè)這2 個(gè)基因?qū)τ谏a(chǎn)性狀的影響可能是通過生長軸通路實(shí)現(xiàn)的。

鳥類中的大量研究表明VIP（血管活性腸肽）調(diào)控禽類PRL 的釋放，被稱為PRL 的釋放因子（PRF）。PRL 抑制卵泡刺激素和黃體生成素的釋放，誘導(dǎo)和維持卵巢消退，并啟動(dòng)孵育行為。此外，卵巢的排卵刺激能夠維持母雞體內(nèi)循環(huán)PRL 水平升高[18]。Zhou 等[11]對(duì)寧都三黃雞的VIP基因上-2 648 bp 到-2 650 bp“AGG”插入缺失進(jìn)行基因分型并進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明“AGG”插入缺失與90 d 至300 d 的卵總數(shù)和90 d 至300 d 的合格卵總數(shù)相關(guān)。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)VIP基因上的SNP22（-49 584 027 到-49 584 029“AGG”插入缺失）與300 日齡總產(chǎn)蛋數(shù)、瑕疵蛋數(shù)顯著或極顯著相關(guān)，進(jìn)一步表明VIP基因與母雞繁殖性狀相關(guān)。

脊椎動(dòng)物中，生殖節(jié)律受腦-垂體-性腺（BPG）軸的調(diào)節(jié)。腦垂體分泌的促性腺激素（GtH）受到大腦釋放的促性腺激素釋放激素（GnRH）的調(diào)控[19]，GnRH 通過其受體（GnRHR）刺激垂體中促性腺激素的釋放[20]，在繁殖調(diào)控中起重要作用。本研究中首次發(fā)現(xiàn)GnRHR基因上的SNP _1（G18251509A）位點(diǎn)與蛋型指數(shù)和開產(chǎn)體重顯著相關(guān)，揭示了GNRHR介導(dǎo)的PBG 軸與母雞生產(chǎn)性狀存在潛在相關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)廣西麻雞9 個(gè)候選基因（GnRHR、IGF-1、NPY、PRL、ESRβ、ESRα、PRLR、VIP、GHR）中18 個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)性，通過100 000 次重排檢驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)SNP_14與300 日齡總產(chǎn)蛋數(shù)和瑕疵蛋數(shù)仍舊保持極顯著相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)共有14 個(gè)位點(diǎn)與蛋品質(zhì)性狀、生產(chǎn)性狀存在一定的關(guān)聯(lián)，這些SNPs 位點(diǎn)可為我國地方品種的標(biāo)記輔助選擇提供參考。