劉 楊，張萬圣，顧仁濟，劉 云

專題報道（一）

綠茶提取物EGCG對老年癡呆鼠和肥胖鼠的改善作用研究

劉 楊，張萬圣，顧仁濟，劉 云

（北京化工大學 生命科學與技術學院，北京 100029）

以老年癡呆癥和肥胖癥模型小鼠為實驗對象，每天用50 mg/kg的綠茶提取物（-）表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）喂食30 d，分別從實驗鼠的外形、生化指標和組織切片等指標進行分析，探討EGCG對老年癡呆癥和肥胖的改善作用。結果表明，EGCG能改善老年癡呆癥小鼠大腦認知水平，作用機制可能與腦組織膽堿乙酰轉移酶（ChAT）和乙酰膽堿酯酶（AchE）酶活、丙二醛（MDA）含量和-淀粉樣蛋白-42（A42）沉積有關。EGCG具有抑制肥胖功效，其作用機制可能與體內血清脂肪酶和淀粉酶活力有關，影響脂肪和能量代謝。同時，EGCG還具有一定的修復肥胖引起的肝損傷的作用。這一研究成果為綠茶功能食品的開發(fā)奠定了理論基礎。

綠茶提取物；（-）表沒食子兒茶素沒食子酸酯；老年癡呆癥鼠；肥胖鼠；膽堿乙酰轉移酶；乙酰膽堿酯酶；-淀粉樣蛋白-42；肝組織空泡化；脂肪浸潤

綠茶中含豐富的兒茶素，約為干重的30%~ 42%。兒茶素有多種結構類似物，包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯((-)-epicatechin gallate，ECG)、表沒食子酸酯兒茶素（(-)-epigallocatechin，EGC）和沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-Gallocatechin gallate，GCG）等，其中，EGCG含量最高，約占茶多酚總量80%[1]。文獻報道，EGCG具有多種生理活性[1]，如清除自由基，防止活性氧生成等抗氧化活性[2]、抗菌和抗病毒活性等[3]。研究表明，EGCG是癌癥[4]、糖尿病[5]、肥胖[6]以及老年癡呆癥[1]等患者的潛在改善劑。

EGCG改善老年癡呆癥的作用機制與淀粉樣A蛋白成纖有關。譬如，劉楊等和Zhan等研究表明[1,7]，EGCG能改變A蛋白的聚集路徑，形成無規(guī)則、無毒性聚集體，降低毒性。有研究顯示，EGCG影響A淀粉樣蛋白聚集成纖不是通過改變A蛋白的聚集路徑，而是通過影響成纖過程中的最初成核階段[8]。熱力學研究表明，EGCG與A42蛋白相互作用是氫鍵和疏水作用的非特異性結合[9]。多酚化學結構明顯影響淀粉樣A蛋白聚集效果，多酚化合物結構中的羥基數目和位置均對淀粉樣蛋白聚集的抑制效果起到關鍵作用[10-11]。

EGCG作為糖尿病和肥胖患者的改善劑，其作用機理是抑制人體內α-淀粉酶和脂肪酶活性，從而影響葡萄糖和脂肪代謝。Wang等[12]從分子水平上，揭示了EGCG與胰脂肪酶相互作用關系，探討EGCG對脂肪酶活力和抑制類型、酶蛋白結構、反應動力學和熱力學等影響。Fei等[13]報道茶多酚不僅有效地抑制a-淀粉酶活力，而且還都能改變α-淀粉酶構象。Cheng等[14]認為茶多酚抑制淀粉酶活力與其結構上的羥基數量和位置有關，相比ECG而言，EGCG抑制a-淀粉酶活性要強。Forester等[15]通過動物喂養(yǎng)實驗發(fā)現，EGCG降低實驗鼠體內血糖濃度，原因是EGCG抑制了體內淀粉酶活力。

本文以SAMP8老年癡呆鼠和ob/ob肥胖小鼠為模型，通過喂食30 d后，觀察實驗鼠外形、生化特性和組織形態(tài)切片等指標變化，探討EGCG對老年癡呆鼠和肥胖鼠的改善作用機制，為EGCG功能食品的開發(fā)奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與動物分組

綠茶提取物EGCG，EGCG純度≥98%：上海綠葉生物技術有限公司。

SAMP-8老年癡呆實驗模型小鼠：數量10只，雄性，體重(27±2) g，年齡3個月，實驗分兩組，每組5只。SAMR-1小鼠為實驗對照組：數量5只，雄性，體重(29±2) g，年齡3個月，健康。

ob/ob肥胖實驗模型小鼠：數量10只，雄性，體重(27±2) g，年齡5個月，實驗分兩組，每組5只。C57BL/6小鼠為實驗對照組：數量5只，雄性，體重(20±2) g，年齡5個月，健康。

實驗小鼠購于北大實驗動物中心，飼養(yǎng)條件：溫度(23±2) ℃，濕度50%±10%，光照12 h晝夜交替，自由取食。

實驗前，首先將模型小鼠進行7d的適應性飼養(yǎng)，然后將模型小鼠隨機分為數量相等的兩組，一組為陽性對照組（患病組），另一組為EGCG處理組（給藥組）。同齡健康小鼠為陰性對照組（Control組）。喂食30 d期間，給藥組小鼠每天給為50 mg/kg/d的EGCG，給藥方式為灌胃給藥，陽性和陰性對照組小鼠同樣以灌胃給藥方式，每天給以50 mg/kg/d的生理鹽水。

1.2 體長、體重和Lee’s體重指數

實驗肥胖小鼠的體長和體重分3個階段測量，給藥前為第1階段測量并記錄小鼠的體重和體長；給藥期間，每3 d測量1次并記錄小鼠體重為第2階段；等喂食30 d結束后，第3階段測量并記錄小鼠體重和體長。根據給藥前后小鼠體重和體長的變化，計算肥胖鼠Lee’s指數，計算公式如下：

1.3 組織樣品的分離與稱重

按照文獻[16]方法和步驟，分離動物組織。簡單來說，喂食30 d結束后，殺死老年癡呆小鼠，分離腦組織，先浸泡于0.9%鹽水中，然后解剖大腦皮層和海馬區(qū)，稱重，評價EGCG給藥前后，老年癡呆小鼠腦組織重量的變化。

喂食30 d結束后，殺死肥胖小鼠，分離小鼠腹腔內脂肪組織和肝組織，分別稱濕重，計算脂肪組織相對重量，評價EGCG給藥前后，肥胖小鼠脂肪組織重量的變化。

1.4 生化指標檢測

1.4.1 乙酰膽堿酯酶（AchE）和乙酰膽堿轉移酶（ChAT）活力測定

研究表明，反映老年癡呆患者的重要生化指標之一，就是腦組織中AchE和ChAT活力發(fā)生改變[17]。將預冷的裂解液分別加入到上述分離得到的大腦皮層（cerebral cortex）和海馬區(qū)（Hippocampus）組織中，充分勻漿后，4 ℃高速離心10 min，轉速為13 000 ×g，之后輕輕吸取上清液加入2 mL離心管中，置于4 ℃冰箱中備用。按照酶活檢測試劑盒說明書操作步驟，采用分光光度法，測定AchE和ChAT活力，評價EGCG給藥前后，對老年癡呆鼠腦組織生化指標改善的影響。

1.4.2 丙二醛（MDA）含量測定

體內脂質過氧化終產物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的蓄積，會誘發(fā)神經元凋亡，導致大腦認知功能障礙[18]。根據文獻[1]方法，分析小鼠大腦皮層（cerebral cortex）和海馬區(qū)（Hippocampus）勻漿中的MDA含量變化，評價EGCG喂食前后，對老年癡呆鼠改善作用的影響。

1.4.3 血脂指標測定

按照文獻[1]所述步驟，根據試劑盒說明書操作方法，分別測定實驗小鼠血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）和游離脂肪酸（FFA）的含量，評價EGCG喂食前后，對肥胖鼠改善作用的影響。

1.4.4 淀粉酶和脂肪酶活力測定

根據酶活檢測試劑盒說明書操作步驟，分析小鼠血漿樣品中淀粉酶和脂肪酶活力，評價EGCG喂食前后，對肥胖鼠改善作用的影響。

1.5 組織形態(tài)學觀察

1.5.1 蛋白組織免疫學分析

通過腦組織病理切片和蛋白免疫組化方法，分析A42蛋白在海馬體和大腦皮層的沉積情況，初步探討EGCG喂食前后，對老年癡呆鼠改善作用機制，具體分析方法和步驟詳見文獻[1][19]。

1.5.2 脂肪組織切片觀察

依次將小鼠脂肪組織進行4%甲醛固定、石蠟包埋、4 μm厚切片和HE染色等處理后，采用光學顯微鏡，放大倍數（×100倍和×400倍）條件下觀察脂肪組織形態(tài)變化[1]。

1.5.3 肝組織切片觀察

類似1.5.2操作方法，采用HE染色和油紅（Oil red O）染色，分析肝組織病理變化。

1.6 統計學分析

所有實驗數據采用SPASS 22.0 進行方差分析和顯著性檢驗（<0.05），用平均數±SD表示最終數據結果。

2 結果與討論

2.1 EGCG對老年癡呆小鼠和肥胖小鼠體長、體重和Lee’s指數的影響

實驗小鼠喂食EGCG前后，小鼠體重和體長的變化值，以及肥胖小鼠的Lee’s指數等測定結果列于表1。由表1可知，對于老年癡呆模型小鼠而言，陰性對照組、陽性對照組（AD組）和給藥組（EGCG組）相比，經統計學分析，小鼠體重和體長沒有呈現顯著性變化，表明大腦認知功能障礙不會影響實驗小鼠的正常食物攝入，不影響小鼠體重和體長的發(fā)育。這一現象與Liu等[20]報道結果相一致，Liu等認為，EGCG喂食老年癡呆鼠12周，小鼠的體重和食物攝入沒有明顯變化[20]。對于肥胖模型小鼠來講，相比陰性對照組，陽性對照組和EGCG給藥組小鼠體重變化，具有統計學上的顯著性變化（<0.05），體重明顯增加，但是EGCG給藥組比陽性對照組小鼠的體重要輕，結果表明，EGCG可能有效地抑制肥胖小鼠的體重增加。

表1 EGCG對實驗小鼠體重和體長變化以及Lee’s指數的影響

注：a:<0.001 vs Control; b:<0.05 vs Obese; c:<0.05 vs Control; d:<0.001 vs Obese

2.2 EGCG對老年癡呆小鼠腦組織生化指標和蛋白免疫學的影響

2.2.1 AChE和ChAT酶活分析

AchE和ChAT是調控乙酰膽堿神經遞質的重要酶系，乙酰膽堿神經遞質的下降，會導致大腦認知功能的降低，誘發(fā)老年癡呆病癥[21]。通過分析實驗小鼠的腦組織海馬體和大腦皮層中AchE和ChAT酶活力變化，研究EGCG喂食對老年癡呆鼠的改善作用機制，實驗結果見表2。

表2 EGCG對老年癡呆鼠腦組織AchE和ChAT酶活力的影響

由表2可知，相對于陰性對照組，AD組小鼠腦組織海馬區(qū)和大腦皮層中的AchE和ChAT活力較低。EGCG給藥30 d后，AchE和ChAT活力增加，接近甚至略高于陰性對照組，表明EGCG 對老年癡呆鼠的大腦認知功能有一定改善作用。這一結果在文獻報道中也得到驗證[22]。Wang等[22]報道，增強ChAT活力，提高乙酰膽堿神經遞質水平，對大腦神經有良好的保護作用。

2.2.2 MDA含量分析

MDA是脂質過氧化最終產物，反映細胞氧化應激損傷程度的重要指標[1,7]。實驗小鼠腦組織海馬區(qū)（Hippocampus）和大腦皮層（cerebral cortex）中MDA含量變化結果見圖1。

圖1 老年癡呆小鼠腦組織中MDA含量變化的影響

由圖1可知，相比于陰性對照組control小鼠腦組織海馬區(qū)（145 nmol/mg）和大腦皮層（110 nmol/mg）而言，陽性對照組AD小鼠腦組海馬區(qū)（161 nmol/mg）和大腦皮層（137 nmol/mg）MDA含量要高，表明老年癡呆鼠腦組織中MDA水平較高，這一結果與前人報道相一致[23]。EGCG給藥30 d后，小鼠腦組織海馬區(qū)MDA含量下降，基本與陰性對照組相接近，表明EGCG可以降低脂質過氧化應激對大腦的損傷，有利于老年癡呆鼠神經改善。Yin等[24]研究發(fā)現，EGCG可以降低鉛誘導的老年癡呆鼠腦組織海馬區(qū)MDA水平。有趣的是，實驗發(fā)現EGCG給藥組小鼠大腦皮層MDA含量（(144.52±26.74) nmol/mg）上升，表明EGCG給藥組小鼠大腦皮層仍存在一定的氧化應激損傷。這一現象與Wu等[25]實驗結果相一致，文獻作者同樣發(fā)現，EGCG對腦缺血I/R模型大鼠腦組織海馬區(qū)和大腦皮質中MDA水平影響，存在差異。

2.2.3 蛋白組織免疫學分析

實驗小鼠腦組織海馬體選擇了3個區(qū)域，分別為CA31、CA3和DG區(qū)，大腦皮層選擇1個區(qū)域為CER區(qū)，分析A42蛋白在腦組織中的沉積情況，進一步探討EGCG喂食對老年癡呆鼠腦組織認知功能的改善作用機制，結果見圖2。

如圖2所示，圖中藍色表示細胞核，圖中棕黃色表示A42蛋白沉積體。結果表明，雖然陰性對照組小鼠腦組織海馬體和大腦皮層均有少量A42蛋白沉積體，但是，陽性對照組小鼠的海馬體和大腦皮層中，A42蛋白沉積體明顯增多。EGCG給藥30 d后，小鼠海馬體和大腦皮層中A42蛋白沉積體少于陽性對照組，基本接近陰性對照組，這一現象在小鼠海馬CA3區(qū)尤為明顯（圖2D-F）。采用image-Pro 6.0測定了陽性對照組和給藥組小鼠腦組織的平均光密度值（見圖2左上角數字），定量說明A42蛋白沉積體數量。相比陽性對照組而言，EGCG給藥組小鼠腦組 織中A42沉積體平均光密度值低，表明A42蛋白在小鼠腦組織中沉積受到了抑制。研究認為，A42蛋白沉積成纖，是誘發(fā)老年癡呆病癥的主要原因[1,7]。Liu等[26]同樣證實了上述結論，EGCG給藥4周后，經統計學分析，APP/PS1小鼠海馬區(qū)A42蛋白沉積物明顯低于模型組（<0.05）。

圖2 EGCG對老年癡呆鼠腦組織海馬區(qū)和大腦皮層區(qū)Ab42蛋白沉積的影響

2.3 EGCG對肥胖小鼠脂肪組織生化特性的 影響

研究了肥胖小鼠喂食EGCG前后，小鼠各臟器脂肪組織的重重變化，結果見圖3a。由圖3a可知，與陰性對照組相比，陽性對照組小鼠腹腔內腸系膜（Mensenteric）、附睪（Epididymal）、腹膜（Retroperitoneal）的脂肪重量以及脂肪總重量均呈現顯著升高趨勢（<0.001）。EGCG給藥30 d后，與陽性對照組相比，給藥組小鼠各臟器脂肪組織明顯下降（<0.05），表明EGCG對肥胖小鼠有一定的抑制作用。圖3b表示實驗小鼠的肝臟重量和肝指數變化情況，陽性對照組小鼠的肝重和肝指數都明顯高于陰性對照組（<0.001），EGCG給藥30 d后，小鼠的肝臟重量和肝指數有所下降，但是，沒有呈現統計學上的顯著性。實驗小鼠血清中總膽固醇（TC）、甘三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）和游離脂肪酸（FFA）等生化指標變化情況見圖3c。由圖可知，與陰性對照組相比，陽性對照組小鼠血清各項指標均高。EGCG給藥30 d后，相比陽性對照組來講，給藥組小鼠血清大部分指標都有所降低，經統計學分析，TC降低效果顯著（<0.05），但是血清中HDL-C指標比陰性對照組上升，提高了約1.36倍。一般來說，高密度脂蛋白可以將身體中膽固醇運輸到身體各個器官，來提高身體免疫力，防止動脈粥狀硬化。通過實驗小鼠血清指標分析表明，EGCG可以改善肥胖小鼠血清指標，對肥胖有一定抑制效果，這一結論與Hong等[27]報道相一致。最后，采用酶活檢測試劑盒，分析了實驗小鼠血清中脂肪酶（lipase）和淀粉酶（amylase）活力，結果見圖3d。由圖可知，EGCG喂食30 d后，與陽性對照組相比，給藥組小鼠血清中脂肪酶活力基本不變，而淀粉酶活力降低，表明在體內生理條件下EGCG是通過抑制淀粉酶活力，降低能量過度攝入，來發(fā)揮抑制肥胖功效的作用。這一結論與Rouse等[28]報道相一致，文獻作者采用高脂和高碳水化合物飼料來喂飼模型小鼠，之后皮下注射艾塞那肽6周，檢測小鼠血清中脂肪酶和淀粉酶活力，結果顯示脂肪酶活力沒有發(fā)生變化，而淀粉酶活力卻下降了，證明了EGCG通過降低小鼠能量攝入來抑制肥胖。

圖3 EGCG對肥胖小鼠脂肪組織生化特性的影響

（注：***表示為<0.001，**表示為<0.05）

2.4 EGCG對肥胖小鼠組織形態(tài)的影響

2.4.1 EGCG對小鼠脂肪組織形態(tài)的影響

EGCG喂食30 d前后小鼠脂肪細胞形態(tài)，結果見圖4。按照文獻[29]報道方法,計算脂肪組織細胞橫截面積，結果見圖5。

圖4 小鼠脂肪組織形態(tài)觀察

圖5 EGCG對小鼠脂肪細胞橫截面積的影響

（注：***表示為<0.001）

由圖4可知，陰性對照組小鼠的脂肪細胞排列規(guī)整，細胞膜形態(tài)清晰，陽性對照組小鼠的脂肪細胞內腔體積增大，細胞排列松散，細胞膜變得模糊。EGCG喂食30 d后，給藥組小鼠脂肪細胞的細胞膜雖然仍不十分清晰，但是，與陽性對照組相比，給藥組小鼠脂肪細胞內腔體積變小，細胞排列相對緊湊。由脂肪組織橫截面積大小可知（圖5），與陽性對照組相比，EGCG喂食30 d后，EGCG給藥組小鼠脂肪細胞橫截面積顯著降低（<0.001），表明EGCG具有一定的抑制小鼠肥胖的功效。類似地，Melo等[30]從小鼠脂肪細胞的橫截面積的變化，認為天然三萜類樺木酸對小鼠減肥有一定作用。

2.4.2 EGCG對小鼠肝組織形態(tài)的影響

通過組織切片，觀察實驗小鼠肝組織形態(tài)的變化情況，研究EGCG肥胖引起肝組織損傷的修復功效，結果見圖6。

圖6 EGCG修復肥胖引起的肝損傷

圖6可知，陰性對照組小鼠肝細胞排列整齊，結構清晰，胞漿均勻，而陽性對照組肥胖小鼠肝細胞體積增大，胞漿淺染，細胞核周圍呈明顯空泡化。EGCG喂食30 d后，給藥組小鼠肝組織細胞界限明顯，空泡面積明顯減少，病理癥狀減輕。進一步通過油紅染色，觀察小鼠肝組織脂肪浸潤情況，結果發(fā)現，陰性對照組健康小鼠肝組織切片中未見脂滴，而陽性對照組肥胖小鼠肝組織脂肪浸潤嚴重。EGCG喂食30 d后，給藥組小鼠肝組織脂滴體積變小，脂肪浸潤現象減輕。由此可見，EGCG對肥胖引起的肝臟損傷起到了一定的保護作用。這一結論與Fiorini等[31]報道結果 一致。

3 結論

以模型小鼠為研究對象，從動物組織個體水平，研究了綠茶提取物EGCG對老年癡呆癥鼠和肥胖鼠的改善作用。

EGCG喂食前后，老年癡呆鼠的體長、體重與正常對照組沒有顯著變化，表明老年癡呆這一神經退行性疾病不影響患病小鼠正常飲食和能量攝入。EGCG喂食30 d后，老年癡呆鼠血清中AchE和ChAT活力升高，接近于陰性對照組，說明EGCG可以提高體內乙酰膽堿神經遞質，有利于大腦認知能力的提升。大腦皮層中MDA含量降低，表明EGCG對老年癡呆鼠氧化應激損傷有改善作用。腦組織切片和免疫組化實驗顯示，EGCG能夠抑制小鼠海馬體和大腦皮層中A42沉積，抑制誘發(fā)老年癡呆癥的發(fā)生。

EGCG喂食30 d，肥胖鼠體重、體長和Lee’s指數明顯降低，肝重量和肝指數變化不明顯，血脂指標降低，淀粉酶活力下降，表明EGCG有一定的抑制肥胖功效。組織切片顯示，EGCG對肥胖引起的肝損傷具有一定的保護作用。

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Effect of green tea extract EGCG on the improvement of Alzheimer’s and obesity mice

LIU Yang, ZHANG Wan-sheng, GU Ren-ji, LIU Yun

(College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China)

The present work reports the positive effect of green tea extract EGCG on the improvement of Alzheimer’s and obesity mice with the administration of 50 mg EGCG/kg mice every day for 30 days, and the mechanism is elucidated from three aspects of mice body, biochemical indexes and tissue immunology. The results showed that the EGCG can improve the cognitive function of Alzheimer’s mice, its function mechanism is probably attributed to enzyme activities of choline acetyltransferase (AchE) and acetylcholine esterase (ChAT), as well as the content of malondialdehyde (MDA) in serum and the accumulate of-amyloid protein 42 (A42) in the hippocampus. Furthermore, EGCG has a positive effect on the inhibition against obesity desease, it is related to the enzyme activities of lipase and amlyase in serum of obesity mice, which will affect triglycerol metabolism and energy intake. It is worthily noticed that EGCG can protect obesity-induced liver tissue damage. The findings in this work will provide future directions for development of green tea functional foods.

green tea extract; (-)-epigallocatechin gallate (EGCG); alzheimer’smice; obesity mice; choline acetyltransferase (ChAT); acetylcholine esterase (AchE);-amyloid protein 42 (A42); liver tissue vacuolation; adipose infiltration

TS201.1

A

1007-7561(2020)03-0001-09

10.16210/j.cnki.1007-7561.2020.03.001

2020-03-02

北京市自然科學基金（5142013）；農業(yè)部農業(yè)技術試驗示范與服務支持項目（農產品加工）（2267004600）

劉楊，1990年出生，女，碩士生，研究方向為功能食品的研究.

劉云（ORCID: 0000-0002-7521-3831），男，教授，博導，研究方向為功能食品和生物資源利用，E-mail: liuyun@mail.buct.edu.cn

2020-04-21 11:18:00

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3863.ts.20200420.1721.001.html