付成冰，劉 芳，牛志鵬，胡彩艷

（青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1高原醫(yī)學(xué)研究中心，2生物化學(xué)教研室，青海西寧810000）

GATA結(jié)合蛋白1（GATA binding protein-1，GATA-1）是調(diào)控紅系分化過程不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子［1］，它可通過調(diào)節(jié)微小 RNA（microRNA），如 microRNA-451a（miR-451a），實(shí)現(xiàn)對(duì)紅系分化的精細(xì)調(diào)控。miR-451a主要富集在成熟紅細(xì)胞內(nèi)［2-3］，其在紅系的表達(dá)水平明顯高于其它鏈系，且隨著紅系分化過程持續(xù)升高［4］，動(dòng)物和體外紅系分化模型均證實(shí)miR-451a有助于紅細(xì)胞成熟［5-6］，提示miR-451a是調(diào)控紅系分化的特異性microRNA。

低氧環(huán)境能促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞向紅系定向分化，結(jié)果使骨髓紅系前體細(xì)胞增多［7-8］。低氧條件下大鼠骨髓CD71+細(xì)胞內(nèi)GATA-1的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，表明低氧能誘發(fā)GATA-1的高表達(dá)［9］。然而，低氧條件下GATA-1與miR-451a的相關(guān)性及其在紅系分化過程中的作用還不明確。本項(xiàng)工作以低氧條件下人慢性髓細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞紅系分化模型為研究對(duì)象［10］，檢測(cè)GATA-1和miR-451a在低氧下表達(dá)的變化趨勢(shì)，并分析兩者表達(dá)的相關(guān)性，為闡釋GATA-1可能通過調(diào)控miR-451a參與促進(jìn)低氧下紅細(xì)胞分化過程提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 試劑與儀器

K562細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。RPMI-1640培養(yǎng)液購自HyClone；胎牛血清購自四季青公司；氯化血紅素（hemin chloride）購自北京索萊寶科技有限公司；總RNA提取試劑盒（DP419）、miRNA提取試劑盒（DP501）、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（KR211-02）和miRNA熒光定量PCR試劑盒（208054）均購自TIANGEN；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622）、BCA蛋白定量試劑盒和RNA熒光定量試劑盒（160025891）購自Thermo Fisher Scientific；兔抗人GATA-1單克隆抗體（ab181544）和α-tubulin鼠單克隆抗體購自Abcam；山羊抗兔IgG（SA00001-2）購自 Proteintech；CD235a流式抗體 APC-Cy7（349116）和同型抗體（400230）購自BioLegend。所用引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成，序列見表1。GATA-1過表達(dá)慢病毒（LV-GATA1，記為Up）和GATA-1過表達(dá)陰性對(duì)照慢病毒（LVCON238，記為NC-Up）、GATA-1干擾慢病毒［LV-GATA1-RNAi，記為Down］和GATA-1干擾陰性對(duì)照慢病毒（LVCON077，記為NC-Down）均購自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司。三氣培養(yǎng)箱（Binder）；熒光顯微鏡（Zeiss）；PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf）；7500型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）；流式細(xì)胞儀（Beckman）；Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光成像分析儀（GE Healthcare）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分化模型的建立 K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)液中，分為低氧（hypoxia）組和常氧（normoxia）組，以 5×107/L 的密度分別置于低氧（37℃、1%O2、94%N2、5%CO2、飽和濕度）和常氧（37℃、5%CO2、飽和濕度）培養(yǎng)箱。采用40 μmol/L hemin chloride誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化至48和72 h。

2.2 Western blot檢測(cè)GATA-1核蛋白的表達(dá) 提取細(xì)胞核蛋白，BCA法定量后取5 μg核蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE；轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育GATA-1抗體（1∶10 000）過夜；0.1%TBST清洗后，加II抗（1∶10 000），室溫封閉1 h，洗膜、顯影曝光。以α-tubulin為內(nèi)參照，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/α-tubulin條帶灰度值。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.3 RT-qPCR檢測(cè)γ-globin和GATA-1 mRNA及miR-451a的表達(dá)

2.3.1 γ-globin和GATA-1 mRNA表達(dá)的檢測(cè) 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt方法檢測(cè)γ-globin和GATA-1的mRNA表達(dá)。擴(kuò)增參數(shù)為：95℃ 2 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

2.3.2 miR-451a表達(dá)的檢測(cè) 提取細(xì)胞總miRNA，以O(shè)ligo（dT）18為引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt方法檢測(cè)miR-451a的表達(dá)。擴(kuò)增參數(shù)為：95℃ 15 min；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

2.4 慢病毒感染 將對(duì)數(shù)生長期的K562細(xì)胞以5×107/L的密度接種于6孔板，取Up［滴度4×1011TU/L，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=30］和NCUp（滴度 1×1012TU/L，MOI=30）感染 K562細(xì)胞，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后補(bǔ)加1 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)至96 h，熒光顯微鏡下觀察病毒載體中插入的GFP表達(dá)情況。Down（滴度4×1011TU/L，MOI=30）和NC-Down（滴度1×1012TU/L，MOI=30）的感染方法同上。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD235a的表達(dá) CD235a，又稱血型糖蛋白A（glycophorin A，GPA），是紅系細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物，其表達(dá)量隨紅系分化逐步增高［11］。收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗2遍，以1×1010/L重懸細(xì)胞。取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL CD235a抗體，室溫避光孵育15 min。PBS清洗后，棄上清，用500 μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

2.6 細(xì)胞染色

2.6.1 聯(lián)苯胺染色 收集細(xì)胞，離心棄上清，用PBS清洗2遍后，500 μL PBS重懸。加聯(lián)苯胺染液15 μL，3%H2O210 μL，3 min后加1 μL硝普鈉溶液。取10 μL細(xì)胞懸液均勻在載玻片上，每個(gè)視野下大約200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。未分化的細(xì)胞不著色，分化的細(xì)胞呈深藍(lán)色。

2.6.2 瑞氏-吉姆薩染色 將收集的細(xì)胞均勻涂抹在載玻片上，滴加染液A（0.8～1.0 mL）覆蓋整個(gè)涂抹區(qū)域，染色1 min；再滴加染液B（體積是A液的2～3倍），用吸耳球吹勻，染色約10 min。沖洗殘存染液，晾干后鏡下觀察并進(jìn)行圖片采集。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 K562細(xì)胞紅系分化模型的復(fù)制

RT-qPCR結(jié)果顯示，常氧組γ-globin的mRNA表達(dá)在48 h與0 h相比無顯著性差異（P＞0.05），低氧組48 h其表達(dá)量顯著高于0 h（P＜0.05）；兩組γ-globin的mRNA表達(dá)在72 h表達(dá)均顯著增高（P＜0.05），并且在72 h低氧組顯著高于常氧組（P＜0.05），見圖1A。與0 h相比，兩組細(xì)胞聯(lián)苯胺染色陽性率均顯著升高（P＜0.05），且48和72 h低氧組聯(lián)苯胺染色陽性率均顯著高于常氧組（P＜0.01），見圖1B。與0 h相比，兩組細(xì)胞表面CD235a在48 h時(shí)表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）；72 h低氧組CD235a的表達(dá)顯著高于常氧組（P＜0.01），見圖1C。

2 GATA-1和miR-451a的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，48 h低氧組GATA-1蛋白的表達(dá)量與常氧組相比無顯著差異（P＞0.05），72 h低氧組GATA-1蛋白的表達(dá)量顯著高于常氧組（P＜0.05）；組內(nèi)比較結(jié)果顯示，低氧組GATA-1蛋白的表達(dá)量在72 h顯著高于48 h（P＜0.05），常氧組GATA-1蛋白的表達(dá)量在48和72 h無顯著差異（P＞0.05），見圖2A。RT-qPCR結(jié)果顯示，低氧組GATA-1 mRNA的表達(dá)量在72 h較48 h顯著升高（P＜0.05），且顯著高于常氧組（P＜0.05），常氧組在48和72 h無顯著差異（P＞0.05），見圖2B。miR-451a在低氧組72 h時(shí)表達(dá)顯著增高（P＜0.05），且顯著高于常氧組（P＜0.05），常氧組miR-451a的表達(dá)在48和72 h無顯著差異（P＞0.05），見圖2C。

Figure 1.The erythroid differentiation model of K562 cells was replicaed.A：the mRNA expression of γ-globin was detected by RT-qPCR；B：the positive cells of benzidine staining at 48 h and 72 h（scale bar=100 μm）；C：the expression of erythroid specific marker，glycophorin A（CD235a），was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normoxia group；#P＜0.05 vs 0 h.圖1 K562細(xì)胞向紅系分化模型的復(fù)制

3 低氧條件下GATA-1和miR-451a表達(dá)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，低氧組GATA-1的mRNA表達(dá)與miR-451a的表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.850（P＜0.01），見圖3。

4 低氧條件下過表達(dá)或干擾GATA-1的表達(dá)對(duì)紅系分化的影響

4.1 過表達(dá)GATA-1可促進(jìn)紅系分化 與光學(xué)顯微鏡同一視野相比，熒光倒置顯微鏡顯示，Up組90%以上細(xì)胞呈綠色熒光，見圖4。Western blot檢測(cè)過表達(dá)后GATA-1的表達(dá)量，結(jié)果顯示，Up組出現(xiàn)雙條帶且表達(dá)量顯著高于NC-Up組（P＜0.05），見圖5。低氧下Up組γ-globin的表達(dá)在48和72 h均顯著高于NC-Up組，見圖6A。同時(shí)，聯(lián)苯胺染色結(jié)果也顯示GATA-1過表達(dá)可顯著增加聯(lián)苯胺陽性率（P＜0.05），見圖6B。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，低氧誘導(dǎo)72 h后Up組細(xì)胞表面CD235a的表達(dá)顯著高于NC-Up組（P＜0.05），見圖6C。細(xì)胞形態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Up組在48和72 h時(shí)體積增大、核偏移和核縮小的細(xì)胞數(shù)目均顯著多于NC-Up組（P＜0.01），見圖6D。

Figure 2.Expression of GATA-1 and miR-451a in the two groups.A：the protein expression of GATA-1 in the nucleus detected by Western blot（N：normoxia；H：hypoxia）；B：the mRNA expression of GATA-1 detected by RT-qPCR；C：the expression of miR-451a detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs normoxia group；#P＜0.05 vs 48 h.圖2 GATA-1和miR-451a在兩組細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 3.Correlation analysis between GATA-1 and miR-451a under hypoxia.圖3 GATA-1與miR-451a在低氧條件下的相關(guān)性分析

Figure 4.The fluorescence detection of GATA-1 over-expression lentivirus 96 h after infection（scale bar=50 μm）.A，B：NC-Up group；C，D：Up group.A，C：light microscopy；B，D：fluorescence microscopy.圖4 GATA-1過表達(dá)慢病毒感染96 h后的熒光檢測(cè)

Figure 5.The protein expression of GATA-1 in UP group and NC-Up group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC-Up group.圖5 過表達(dá)慢病毒感染后GATA-1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

Figure 6.GATA-1 over-expression enhanced erythroid differentiation of the K562 cells under hypoxia condition.A：the relative mRNA expression of γ-globin detected by RT-qPCR；B：the results of benzidine staining（scale bar=100 μm）；C：the expression of CD235a detected by flow cytometry；D：the results of Wright-Giemsa staining（scale bar=10 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC-Up group.圖6 低氧下過表達(dá)GATA-1后促進(jìn)紅系分化

4.2 干擾GATA-1可抑制紅系分化 與光學(xué)顯微鏡同一視野相比，熒光倒置顯微鏡顯示，Down組大于90%的細(xì)胞呈綠色熒光，見圖7。Western blot檢測(cè)干擾后GATA-1的表達(dá)量，Down組顯著低于NC-Down組（P＜0.05），見圖 8。與NC-Down組相比，低氧下Down組γ-globin mRNA的表達(dá)水平在72 h顯著降低（P＜0.05），見圖9A。聯(lián)苯胺染色結(jié)果也顯示干擾GATA-1可顯著降低聯(lián)苯胺陽性率（P＜0.05），見圖9B。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，Down組在誘導(dǎo)72 h后細(xì)胞表面的CD235a表達(dá)水平顯著低于NC-down組（P＜0.05），見圖9C。細(xì)胞形態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NCDown組相比，Down組在72 h時(shí)體積增大、核偏移和核縮小的細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P＜0.01），見圖9D。

Figure 7.The fluorescence detection of GATA-1 knock-down lentivirus 96 h after infection（scale bar=50 μm）.A，B：NC-Down group；C，D：Down group.A，C：light microscopy；B，D：fluorescence microscopy.圖7 GATA-1干擾慢病毒感染96 h后熒光檢測(cè)

5 低氧條件下過表達(dá)或抑制GATA-1后miR-451a的表達(dá)檢測(cè)

5.1 過表達(dá)GATA-1可促進(jìn)miR-451a表達(dá) RT-qPCR檢測(cè)GATA-1過表達(dá)后miR-451a的表達(dá)，結(jié)果顯示，低氧下誘導(dǎo)48 h后Up組miR-451a的表達(dá)量與NC-Up組相比無顯著差異（P＞0.05），72 h時(shí)Up組miR-451a的表達(dá)量顯著高于NC-Up組（P＜0.05），見圖10。

5.2 干擾GATA-1可抑制miR-451a表達(dá) RT-qPCR檢測(cè)GATA-1抑制后miR-451a的表達(dá)，結(jié)果顯示，低氧下誘導(dǎo)48 h后Down組miR-451a的表達(dá)量與NCDown組相比無顯著差異（P＞0.05），72 h時(shí)Down組miR-451a的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），見圖11。

討 論

Figure 8.The protein expression of GATA-1 in Down group and NC-Down group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCDown group.圖8 干擾慢病毒感染后GATA-1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

GATA-1作為紅系核心轉(zhuǎn)錄因子，主要通過靶向激活β-珠蛋白基因［12］、促紅細(xì)胞生成素及其受體（erythropoietin/erythropoietin receptor，Epo/EpoR）［13］和microRNAs等的表達(dá)，促進(jìn)紅系分化。miR-451a的表達(dá)受GATA-1調(diào)控。在K562細(xì)胞紅系分化模型中，GATA-1可激活miR-144/451基因簇上游區(qū)164 bp、570 bp和1 281 bp三個(gè)保守位點(diǎn)［14］，促進(jìn) miR-451表達(dá)。在人的17號(hào)染色體上，GATA-1可結(jié)合miR-144/451基因簇上游3.8 kb位點(diǎn)，激活RNA聚合酶Ⅱ?qū)iR-451的轉(zhuǎn)錄［15］。利用基因芯片技術(shù)比較紅系分化中miRNAs表達(dá)譜和GATA-1缺失的原紅細(xì)胞系G1E在GATA-1恢復(fù)后miRNA的表達(dá)，顯示miR-451a在正常紅系分化過程中表達(dá)逐漸上調(diào)，且受到GATA-1的正向調(diào)控［16］，表明GATA-1正向調(diào)控miR-451具有促紅系分化作用。鼠的胚胎干細(xì)胞過表達(dá)miR-451a后，其細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白含量增高并伴有細(xì)胞表面 CD235a和TER-119 表達(dá)升高［5］，提示miR-451過表達(dá)能促進(jìn)鼠胚胎干細(xì)胞向紅系分化。miR-451在臍血來源的CD34+造血干祖細(xì)胞紅系分化的早期階段開始表達(dá)，持續(xù)到晚幼紅階段并處于高表達(dá)，其可作用于GATA-2的3′-非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR），下調(diào)GATA-2的表達(dá)繼而促進(jìn)紅細(xì)胞成熟［17-18］。研究顯示，低氧下GATA-1表達(dá)增高。利用質(zhì)譜分析大鼠NRK-49F細(xì)胞在低氧下核蛋白表達(dá)變化時(shí)，顯示GATA-1的表達(dá)顯著增高［19］，提示GATA-1受低氧調(diào)控。低氧下肺泡II型細(xì)胞內(nèi)GATA-1表達(dá)顯著升高，誘導(dǎo)血紅蛋白表達(dá)升高［20］。進(jìn)一步研究證實(shí)，低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）在低氧下可上調(diào)K562細(xì)胞和CD34+細(xì)胞內(nèi)GATA-1的表達(dá)，促進(jìn)紅系分化［21］，滿足細(xì)胞在低氧下的需氧要求。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，低氧組K562細(xì)胞中GATA-1的表達(dá)隨誘導(dǎo)時(shí)間延長顯著增加并且在72 h其表達(dá)量顯著高于常氧組。但miR-451a在低氧下是否影響紅系分化鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，miR-451a的表達(dá)雖然在常氧組48 h和72 h無顯著變化，但在低氧組其表達(dá)顯著增加且表達(dá)量在72 h時(shí)顯著高于常氧組，提示低氧能夠誘導(dǎo)miR-451a表達(dá)促進(jìn)紅系分化。但GATA-1對(duì)miR-451a的調(diào)控關(guān)系在低氧下紅系分化過程中的作用還不清楚。

Figure 9.GATA-1 knock-down inhibited erythroid differentiation of the K562 cells under hypoxia condition.A：the relative expression of γ-globin detected by RT-qPCR；B：the results of benzidine staining（scale bar=100 μm）；C：the expression of CD235a detected by flow cytometry；D：the results of Wright-Giemsa staining（scale bar=10 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC-Down group.圖9 低氧下干擾GATA-1后抑制紅系分化

Figure 10.GATA-1 over-expression increased the expression of miR-451a under hypoxia.The expression of miR-451a was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC-Up group.圖10 低氧下過表達(dá)GATA-1可促進(jìn)miR-451a表達(dá)

Figure 11.GATA-1 knock-down decreased the expression of miR-451a under hypoxia.The expression of miR-451a was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC-Down group.圖11 低氧下干擾GATA-1可抑制miR-451a表達(dá)

依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，本課題組復(fù)制低氧下K562細(xì)胞紅系分化模型。γ-globin和CD235a的表達(dá)均表現(xiàn)為隨誘導(dǎo)時(shí)間延長顯著增加，表明低氧K562細(xì)胞紅系分化模型復(fù)制成功。低氧組γ-globin的mRNA表達(dá)顯著高于常氧組，這一結(jié)果與Kaneko等［22］研究結(jié)果相符合。利用聯(lián)苯胺染色法檢測(cè)血紅蛋白的表達(dá)可用來評(píng)價(jià)紅系分化程度［23］。聯(lián)苯胺染色結(jié)果顯示低氧組細(xì)胞陽性率顯著高于常氧組，與γ-globin結(jié)果相一致，說明低氧有助于γ-globin表達(dá)。GATA-1與miR-451a間的相關(guān)性分析表明，低氧組GATA-1與miR-451a呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，提示低氧下GATA-1與miR-451a之間的正相關(guān)性與K562細(xì)胞紅系分化有關(guān)。采用慢病毒感染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其相關(guān)性。低氧下GATA-1過表達(dá)能夠增強(qiáng)紅系分化指標(biāo)的表達(dá)，同時(shí)瑞氏-吉姆薩染色作為分析紅細(xì)胞典型特征變化的方法［24］，其結(jié)果顯示Up組體積增大、核偏移和核縮小的細(xì)胞數(shù)目比NC-Up組顯著增多，提示低氧下GATA-1過表達(dá)有利于K562細(xì)胞紅系分化。低氧下干擾GATA-1表達(dá)可減弱紅系分化指標(biāo)的表達(dá)，同時(shí)瑞氏-吉姆薩染色顯示Down組體積增大、核偏移和核縮小的細(xì)胞數(shù)目顯著減少，提示低氧下干擾GATA-1表達(dá)能抑制紅系分化。低氧下過表達(dá)GATA-1后miR-451a在72 h顯著高于對(duì)照組，而干擾GATA-1后miR-451a在72 h顯著低于對(duì)照組，提示低氧下GATA-1可正向調(diào)控miR-451a的表達(dá)。

綜上所述，本研究通過K562細(xì)胞紅系分化模型，分析低氧下GATA-1與miR-451a的表達(dá)情況和相關(guān)關(guān)系，提示低氧可誘導(dǎo)GATA-1表達(dá)增高，進(jìn)而加強(qiáng)miR-451a的表達(dá)，這種正相關(guān)關(guān)系參與低氧促紅系分化過程。