徐文杰 韓士群 周慶 巫佳杰 陳婷

摘要：通過40 d的體表暴露試驗(yàn)，研究了飼料中添加α-硫辛酸、抗壞血酸（VC）對鯽魚暴露于銅綠微囊藻污染水體的保護(hù)作用。試驗(yàn)期間水體中微囊藻毒素-LR（MC-LR）質(zhì)量濃度維持在19.40 μg/L左右，試驗(yàn)組飼料中α-硫辛酸和VC的添加量均為600 mg/kg，測定鯽魚生長性能、MC-LR解毒效果和肝臟抗氧化能力。結(jié)果表明，與負(fù)對照組相比，飼料中添加α-硫辛酸組和VC組鯽魚增質(zhì)量率顯著提高（P<0.05），分別提高了4.91%和3.21%;鯽魚肌肉中MC-LR含量顯著降低（P<0.05），分別降低了40.72%、14.20%;肝臟谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、總抗氧化能力（T-AOC）顯著提高（P<0.05），分別提高了79.35%和72.53% 、79.35%和72.53%、34.93%和24.43%;肝臟丙二醛（MDA）含量顯著降低（P<0.05），分別降低了57.26%和48.86%?？梢?，飼料中添加α-硫辛酸、VC能夠顯著提高魚體的抗氧化能力，減輕MC-LR對魚體的氧化損傷，進(jìn)而減少M(fèi)C-LR在魚體內(nèi)的積累，減輕MC-LR對鯽魚的毒害作用。

關(guān)鍵詞：α-硫辛酸;抗壞血酸;微囊藻毒素;鯽魚;抗氧化能力

中圖分類號：S963.73文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0417-06

Abstract：In this study， the effects of dietary α-lipoic acid and ascorbic acid （VC） on microcystin-induced toxicosis in crucian were investigated by 40-days exposure test. During the test， the mass concentration of microcystin-LR （MC-LR） in water was maintained at about 19.40 μg/L. The additions of α-lipoic acid and VC in the experimental group were 600 mg/kg， and the growth performance， MC-LR detoxification and liver antioxidant capacity of the crucian were investigated. Compared with the negative control group， the weight gain rate increased by 4.91% and 3.21% in crucian fed with α-lipoic acid and ascorbic acid （P<0.05）， meanwhile， the MC-LR content in the muscle decreased by 40.72% and 14.20% （P<0.05）， respectively. Furthermore， activity of glutathione peroxidase （GSH-Px） increased by 79.35% and 72.53% （P<0.05）， the activity of superoxide dismutase （SOD） increased by 79.35% and 72.53% （P<0.05）， and the total antioxidant capacity （T-AOC） increased by 34.93% and 24.43% （P<0.05）， malondialdehyde （MDA） content decreased by 57.26% and 48.86% （P<0.05） in crucian fed with α-lipoic acid and VC. In conclusion， dietary α-lipoic acid and VC can effectively improve the antioxidant capacity of crucian， reduce the oxidative damage and the accumulation of MC-LR.

Key words：α-lipoic acid;ascorbic acid;microcystin;crucian;antioxidant capacity

中國是世界漁業(yè)大國，淡水養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量位列世界第一。自20世紀(jì)90年代以來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速并呈現(xiàn)高密度、集約化、規(guī)?；奶攸c(diǎn)，形成了高生物負(fù)載量和高投入量的養(yǎng)殖模式，大量魚類的排泄物和殘留餌料在水體中分解產(chǎn)生大量的氮、磷營養(yǎng)元素，使得水體富營養(yǎng)化日益嚴(yán)重，水華頻頻暴發(fā)[1-3]。水華藻類可合成多種有毒物質(zhì)，最典型的是一類具有生物活性的環(huán)狀七肽，即微囊藻毒素（Microcystins， MC），微囊藻、項(xiàng)圈藻、念珠藻和顫藻等均可產(chǎn)生微囊藻毒素[4]。微囊藻毒素有200多種結(jié)構(gòu)類似物，其中微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR， MC-LR）是最為常見且毒性最強(qiáng)的一種，其次為微囊藻毒素-RR（Microcystin-RR， MC-RR）和微囊藻毒素-YR（Microcystin-YR， MC-YR）。以往的研究結(jié)果表明MC可以積聚在蝸牛、蝦以及淡水湖泊中魚類等水生生物的組織中[5-7]。MC能影響魚類生長速度，導(dǎo)致魚類腮、肝、腎、腸道、心臟等臟器發(fā)生病理學(xué)改變，影響魚類行為并能誘發(fā)魚體內(nèi)相關(guān)解毒酶活性的改變[8-9]。受MC污染的魚類可通過食物鏈對人體健康構(gòu)成威脅。因此，有必要開展增強(qiáng)魚體對抗微囊藻毒素毒害作用的研究。

有研究者指出，污染物脅迫下生物體活性氧的產(chǎn)生及導(dǎo)致的氧化損傷是污染物致毒的重要途徑，MC可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和脂質(zhì)過氧化，MC的肝臟毒性部分也是由于誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生所致[10-11]。α-硫辛酸不僅能夠清除氧自由基、螯合重金屬離子，還具有修復(fù)氧化損傷的作用[12]。VC可以為超氧化物自由基和羥基等提供電子來終止自由基活性，從而減輕自由基對機(jī)體氧化損傷[13]。目前，關(guān)于MC對魚類的毒理以及抗氧化劑對魚解毒的研究中采用的暴露途徑主要為腹腔注射或灌喂，而對低濃度長期體表暴露的毒害作用及抗氧化劑的解毒作用研究比較少，體表暴露能更好地模擬真實(shí)水華水體中MC對魚體的影響，目前有關(guān)VC在緩解微囊藻毒素對魚體毒害作用的研究尚無報道。本研究采用將鯽魚暴露于銅綠微囊藻污染水體中的方式，研究飼料中添加α-硫辛酸、VC對鯽魚生長、毒素在體內(nèi)的積累以及肝臟抗氧化能力的影響。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

產(chǎn)微囊藻毒素銅綠微囊藻（FACHB-912）購于中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫，采用BG11 培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。試驗(yàn)飼料原料為成品飼料，飼料原料經(jīng)過40目篩粉碎，在基礎(chǔ)飼料中分別添加α-硫辛酸、VC使其質(zhì)量比均為600 mg/kg，混合均勻后用擠壓機(jī)制成顆粒直徑為2.0 mm 的飼料，45 ℃烘干冷卻后放入密封袋中于-15 ℃冰箱中保存待用。試驗(yàn)魚為鯽魚，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后用高錳酸鉀溶液浸泡消毒10～15 min，暫養(yǎng)馴化14 d后，挑選體質(zhì)健康、大小基本一致的試驗(yàn)魚（平均質(zhì)量460 g）用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)魚隨機(jī)分為4組（生長在無毒環(huán)境中投喂基礎(chǔ)飼料的正對照組、生長在銅綠微囊藻污染水體中投喂基礎(chǔ)飼料的負(fù)對照組、投喂含α-硫辛酸飼料的試驗(yàn)組1、投喂含抗壞血酸飼料的試驗(yàn)組2），每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)20尾魚，隨機(jī)放入周轉(zhuǎn)箱中進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，試驗(yàn)期40 d。暴露期間，向水體中加入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的銅綠微囊藻培養(yǎng)液，每隔2 d換一半水，并補(bǔ)充銅綠微囊藻培養(yǎng)液至預(yù)設(shè)值。定期采水樣檢測水體中MC-LR質(zhì)量濃度，試驗(yàn)期間MC-LR質(zhì)量濃度基本維持在19.40 μg/L左右，可認(rèn)為暴露期內(nèi)受試鯽魚始終接觸一個恒定的MC-LR暴露質(zhì)量濃度。每天投飼2次（9∶00和16∶00），飼料投喂量為魚體質(zhì)量的4%，根據(jù)魚體增長情況，在投喂率一定的基礎(chǔ)上定期調(diào)整投喂量。試驗(yàn)期間水溫約25 ℃，pH 7.5，氨態(tài)氮<0.02 mg/L。

試驗(yàn)期間，每隔5 d取水樣測定水體中MC-LR質(zhì)量濃度;每隔10 d從各周轉(zhuǎn)箱分別隨機(jī)取2尾魚，稱質(zhì)量后在冰盤上解剖，取背部白肌于-20 ℃冰箱保存，測定肌肉中MC含量。試驗(yàn)結(jié)束后，另取6尾魚于冰盤上解剖，取肝臟，-20 ℃保存，用于測定肝組織蛋白質(zhì)含量、甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量。

1.3測定方法

水體中MC-LR含量的測定：取水樣，過0.45 μm的濾膜，取適當(dāng)體積的濾液注入SPE固相萃取裝置中，使濾液流經(jīng)預(yù)活化的C18固相萃取小柱進(jìn)行富集、淋洗及洗脫。洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用20%的甲醇定容，用于高效液相色譜（HPLC）分析。色譜條件參照GB/T 20466-2006[14]的方法。

魚肌肉MC-LR含量的測定：取背部白肌，樣品經(jīng)冷凍干燥后碾磨成粉末。肌肉樣品MC-LR的提取參照GB5009.273-2016[15]進(jìn)行，肌肉組織中MC-LR含量的測定采用HPLC方法。

肝臟抗氧化能力指標(biāo)測定：取肝臟組織塊（0.1～0.2 g）在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱質(zhì)量，放入5 ml的勻漿管中。按重量（g）∶體積（ml）=1∶9的比例加入9倍體積的0.86%的生理鹽水于勻漿管中，冰水浴條件下，剪碎組織塊，于內(nèi)切式組織勻漿機(jī)中制備成10%的組織勻漿備用。肝組織勻漿蛋白質(zhì)含量、T-AOC、SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量的測定均采用相應(yīng)的試劑盒，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，具體操作流程按照說明書要求進(jìn)行。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析比較處理間差異性。

2結(jié)果

2.1飼料中添加抗氧化劑對鯽魚增質(zhì)量率和存活率的影響

經(jīng)過40 d試驗(yàn)，飼料中添加α-硫辛酸、VC對鯽魚生長及存活的影響如表1所示。從表1中可以看出，各組的存活率均為100%，表明MC-LR暴露質(zhì)量濃度為19.40 μg/L時不能直接導(dǎo)致鯽魚死亡。試驗(yàn)初期，各組魚平均質(zhì)量無顯著差異，經(jīng)過40 d的試驗(yàn)，負(fù)對照組、α-硫辛酸組和VC組魚體平均質(zhì)量[分別為（492.78±9.62） g、（516.33±10.33） g、（504.72±6.15） g]和增質(zhì)量率（分別為6.25%±0.27%、11.16%±0.49%、9.46%±0.20%）均低于正對照組[（529.22±7.91） g、14.37%±0.58%]。說明銅綠微囊藻所釋放的MC-LR對魚體有毒害作用，可抑制魚類的生長。在飼料中添加α-硫辛酸和VC能夠在一定程度上緩解MC-LR對魚體的毒害作用，與負(fù)對照組相比，增質(zhì)量率顯著提高（P<0.05），分別提高了4.91%和3.21%。結(jié)果說明在飼料中添加一定量的α-硫辛酸和VC能夠緩解MC-LR對鯽魚生長的抑制作用。

2.2飼料中添加抗氧化劑對鯽魚肌肉中微囊藻毒素含量的影響

圖1為暴露于MC-LR的各組鯽魚肌肉組織中微囊藻毒素含量變化。正對照組鯽魚肌肉組織中未檢出MC-LR。由圖1可知，經(jīng)過40 d的暴露，MC-LR在鯽魚體內(nèi)出現(xiàn)了不同程度的積累。40 d后，負(fù)對照組、α-硫辛酸組和VC組鯽魚肌肉中MC-LR含量分別為（81.58±2.78） ng/g、（48.36±1.77） ng/g、（69.99±2.41） ng/g。在飼料中添加α-硫辛酸和VC能顯著降低魚肌肉中MC-LR的含量（P<0.05），與負(fù)對照組相比分別降低了40.72%、14.20%，其中α-硫辛酸的效果優(yōu)于VC。

2.3飼料中添加α-硫辛酸、VC對鯽魚抗氧化能力的影響

由圖2可知，經(jīng)過40 d的暴露試驗(yàn)，各處理組和負(fù)對照組魚體肝臟中GSH-Px活性均顯著低于正對照組（P<0.05）。與負(fù)對照組相比，飼料中添加α-硫辛酸和VC后，鯽魚肝臟GSH-Px活性均顯著升高（P<0.05），分別提高了79.35%和72.53%，α-硫辛酸組和VC組之間無顯著差異（P=0.064）。負(fù)對照組肝臟SOD活性顯著低于正對照組（P<0.05），α-硫辛酸組和VC組肝臟SOD活性與負(fù)對照組相比顯著提高（P<0.05），分別提高了79.35%和72.53%。各處理組和負(fù)對照組魚體肝臟中T-AOC均顯著低于正對照組（P<0.05）。與負(fù)對照組相比，飼料中添加α-硫辛酸和VC后，鯽魚肝臟T-AOC 均顯著升高（P<0.05），分別提高了34.93%和24.43%，α-硫辛酸組的總抗氧化能力與VC組無顯著差異。處理組和負(fù)對照組肝臟MDA含量均顯著高于正對照組（P<0.05），α-硫辛酸組、VC組肝臟MDA含量顯著低于負(fù)對照組（P<0.05），分別比負(fù)對照組減少了57.26%和48.86%。

3討論

生長性能是評價魚類健康的一個重要指標(biāo)，通常以增質(zhì)量率來表示。本研究中，負(fù)對照組鯽魚增質(zhì)量率顯著低于正對照組，說明長期暴露于銅綠微囊藻水體中鯽魚生長受到顯著抑制。類似的抑制作用在其他研究中也有報道。Dong 等[16]發(fā)現(xiàn)用含藍(lán)藻的飼料飼喂鯉魚幼魚和雜交鱘后，魚的生長速率顯著下降。暴露于30 μg/g MC-LR 10 d后，鳙魚幼魚的生長受到明顯抑制[17]。以往的研究結(jié)果表明，飼料中添加抗氧化劑硫辛酸能顯著提高奧尼羅非魚生長性能和飼料利用率[18];在飼料中添加適量的VC對石斑魚、泥鰍幼魚生長有明顯的促進(jìn)作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與負(fù)對照組相比，在飼料中添加一定量α-硫辛酸和VC能夠顯著提高鯽魚的平均質(zhì)量和增質(zhì)量率，說明α-硫辛酸和VC能夠緩解MC-LR對魚體的毒害作用。

有關(guān)微囊藻毒素在魚體內(nèi)的累積有許多研究報道。Xie等[20]在巢湖鯉魚的肌肉、肝臟和腸道中均檢出微囊藻毒素，其在肌肉中的含量達(dá)到0.66 μg/g。姜錦林[21]研究指出，暴露于低濃度MC-LR的鯉魚肝臟和肌肉中均積累了一定的MC-LR。本研究中，暴露于MC-LR水體中的鯽魚肌肉中出現(xiàn)MC-LR累積，與其他研究結(jié)果相吻合。試驗(yàn)期間，α-硫辛酸組和VC組鯽魚肌肉中微囊藻毒素含量顯著低于負(fù)對照，說明在飼料中添加α-硫辛酸和VC能夠顯著降低MC-LR在鯽魚體內(nèi)的積累。董桂芳等[22]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加谷胱甘肽（Glutataione， GSH）能顯著降低黃顙魚肌肉和肝臟的MC含量，引起這一現(xiàn)象的原因可能是GSH被魚組織吸收后與微囊藻毒素結(jié)合，更利于GSH和MC結(jié)合物的代謝和排出體外。張麗等[23]的研究結(jié)果表明，添加α-硫辛酸可降低羅非魚體肝臟和肌肉中MC含量，α-硫辛酸能有效阻止GSH在解毒過程中被活性氧（Reactive oxygen species， ROS）氧化為GSSG，并能持續(xù)提高GSH還原酶的活性，加速解毒過程的完成。

GSH-Px、SOD是動物體內(nèi)重要的抗氧化酶，在機(jī)體抗氧化應(yīng)激中起重要作用。GSH-Px可以使有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不受過氧化物干擾及損害[24]。SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基（O2·-），保護(hù)細(xì)胞免受損傷[25-27]。SOD活性的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。MC可以通過多種途徑破壞體內(nèi)自由基的平衡和抗氧化系統(tǒng)的功能，導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷。這些自由基及其產(chǎn)物在細(xì)胞中最具破壞性的作用之一是膜脂的過氧化，MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映生物機(jī)體受到自由基攻擊的程度，是細(xì)胞氧化損傷的敏感診斷指標(biāo)[28-30]。總抗氧化能力（T-AOC）用于衡量生物體抵抗外來刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀態(tài)，包括機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)[31]。MC暴露的主要毒性作用是氧化應(yīng)激。Zhang等[32]報道在12 h試驗(yàn)中注射3次150 g/kg MC-LR的鯽魚肝臟MDA含量顯著增加。許多研究結(jié)果表明使用不同類型的抗氧化劑，可以有效地提高生物的抗氧化能力，進(jìn)而起到降低污染物毒性的作用。Amado等[33]的研究結(jié)果表明，α-硫辛酸可以通過增加鯉魚肝臟和大腦中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性或通過修復(fù)GST抑制刺激解毒，降低MC誘導(dǎo)的毒性。類延菊等[34]的研究結(jié)果表明，飼料中添加硫辛酸顯著提高了銅脅迫下皺紋盤鮑的肝胰臟SOD、GSH-Px活性及GSH含量，顯著降低銅的沉積量，并在一定程度上減輕肝胰臟蛋白質(zhì)、DNA損傷以及脂質(zhì)過氧化。朱選等[35]指出，飼料中添加GSH能夠促進(jìn)草魚肝臟和肌肉中GSH的沉積，提高肝臟中GSH-Px和SOD活性與總抗氧化能力，減少肝臟中MDA含量，降低肝臟及血清中ROS含量。彭士明等[36]的研究結(jié)果表明，增加VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)可顯著提高銀鯧組織中SOD活性及總抗氧化能力。本試驗(yàn)中，處理組和負(fù)對照組魚體肝臟中GSH-Px活性、SOD活性、總抗氧化能力均顯著低于正對照組，MDA含量均顯著高于正對照組，說明鯽魚暴露在MC-LR水體中會造成魚體的氧化機(jī)能損傷;在飼料中添加α-硫辛酸、VC后鯽魚肝臟GSH-Px、SOD活性及T-AOC均顯著高于負(fù)對照組，MDA含量均顯著低于負(fù)對照組，表明飼料中添加α-硫辛酸、VC能夠有效提高魚體的抗氧化能力，進(jìn)而減少M(fèi)C-LR在魚體內(nèi)的積累，減輕MC-LR對鯽魚的毒害作用。

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（責(zé)任編輯：張震林）