文良華，陳世華，壽折星

(1.荊州市公安縣中醫(yī)院骨科，湖北 荊州 434300；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，湖北 武漢 430022)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見(jiàn)的退行性疾病，常伴隨疼痛、短暫晨僵和骨擦音，嚴(yán)重影響患者工作和生活[1-2]。目前的研究顯示，多種因素參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病，如遺傳、生物學(xué)紊亂和生物力學(xué)等，但具體機(jī)制尚不明確[2-3]。臨床中，骨關(guān)節(jié)炎的藥物主要針對(duì)癥狀進(jìn)行消炎鎮(zhèn)痛等治療，緩解疾病進(jìn)展。因此，明確其具體機(jī)制有助于針對(duì)性治療。

微小核糖核酸(micro ribonucleic acids，miRNAs)是一組存在于生物體的非編碼RNA分子，其長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸[4]。miRNAs通過(guò)結(jié)合mRNAs的3'端非翻譯區(qū)，調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，進(jìn)而在多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮作用[5]。研究表明，miRNAs在骨關(guān)節(jié)炎中存在差異表達(dá)，既有上調(diào)表達(dá)，又有下調(diào)表達(dá)。最近一項(xiàng)研究顯示，miR-31-5p在骨關(guān)節(jié)炎患者分離的軟骨間充質(zhì)干細(xì)胞中顯著下調(diào)[6]。然而，miR-31-5p在骨關(guān)節(jié)炎中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在明確miR-31-5p對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡的具體作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12只雄性Sprahur-Dawley(SD)大鼠(11～12周齡)購(gòu)買于長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心，隨機(jī)分為兩組：sham組和OA組，每組各6只。涉及動(dòng)物的操作遵照長(zhǎng)江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑與儀器 戊巴比妥鈉(全式金生物，中國(guó))，蘇木素伊紅染色試劑盒和改良番紅O-固綠染色試劑盒(索萊寶，中國(guó))，胰酶和Ⅱ型膠原酶(懋康生物，中國(guó))，胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，miRNeasy Serum/Plasma試劑盒和miRNeasy Mini試劑盒(Qiagen，德國(guó))，TRIzol(Ambion，美國(guó))，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(Takara，日本)，引物、miR-31-5p mimics和inhibitor、Notch1 siRNA、Notch1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、載有野生型Notch1和突變型Notch1的載體pGL3(生工，中國(guó))，Lipofectamine 3000(Invitrogen，美國(guó))，重組大鼠白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、小鼠抗β-actin一抗和辣根過(guò)氧化物酶耦合二抗(碧云天，中國(guó))，PVDF膜(Millipore，美國(guó))，兔抗Notch1一抗(CST，美國(guó))，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega，美國(guó))，倒置顯微鏡(奧林巴斯，日本)，流式細(xì)胞儀(Accuri C6，美國(guó))，反轉(zhuǎn)錄儀、實(shí)時(shí)定量PCR儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光儀和酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 OA大鼠模型建立 OA大鼠模型的建立主要參照Hulth法[7]。用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)靜脈注射麻醉大鼠，常規(guī)消毒后，在其兩側(cè)后肢行縱向切口2cm，分離并切斷交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶，完整去除內(nèi)側(cè)半月板，不損傷關(guān)節(jié)軟骨面，術(shù)后不固定傷肢，對(duì)大鼠分籠飼養(yǎng)。對(duì)照組僅進(jìn)行皮膚切開(kāi)術(shù)和縫合。

1.3.2 蘇木素-伊紅染色法 取大鼠關(guān)節(jié)處組織進(jìn)行石蠟包埋，切片后常規(guī)脫蠟至水；蘇木素染色10 min后洗片，0.7%鹽酸乙醇分化5 s；洗片后氨水返藍(lán)、水洗，伊紅染色5 min；水洗后經(jīng)乙醇、二甲苯處理，烘干封片。

1.3.3 番紅O-固綠染色法 將石蠟包埋的大鼠關(guān)節(jié)處組織切片進(jìn)行脫蠟至水；用Weigert染液染色5 min，酸性乙醇分化液分化15 s；洗片后用固綠染液染色5 min；再次洗片后用番紅O染液進(jìn)行染色2 min；最后經(jīng)洗片、乙醇脫水后，二甲苯透明，樹(shù)脂封片。

1.3.4 原代細(xì)胞分離培養(yǎng) 無(wú)菌條件下，關(guān)節(jié)軟骨剪碎，用0.25%胰酶和0.2%Ⅱ型膠原酶消化4 h；用濾網(wǎng)過(guò)濾后進(jìn)行離心(1 000轉(zhuǎn)/min)5 min，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 血清miRNAs的提取用miRNeasy Serum/Plasma試劑盒，細(xì)胞微小RNA用miRNeasy Mini試劑盒提取，組織和細(xì)胞總RNA用TRIzol提取，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA后，用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，程序設(shè)定為95℃、10 min，然后40個(gè)循環(huán)為95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s。U6作為微小RNA內(nèi)參，Gapdh作為mRNA內(nèi)參，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)。rno-miR-31-5p：正義鏈5'-TATTCATAGGCAAGATGCTGGC-3'，反義鏈5'-TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3'。U6：正義鏈5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'，反義鏈5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。IL-6：正義鏈5'-TGCTCAGAAGGGAGAGTCTGA-3'，反義鏈5'-TTGCTCCAAGCTTACCGTGA-3'。MMP-13：正義鏈5'-CTGGGCCCTGAATGGGTATG-3'，反義鏈5'-TTGCAAAACCAGTGCAACTAC-3'。Gapdh：正義鏈5'-GGCGGAGATGATGACCCTTT-3'，反義鏈5'-GCCCAGGGCTGACTACAAAC-3'。

1.3.6 細(xì)胞活力測(cè)定 原代軟骨細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約5 000個(gè)，miR-31-5p mimics(1 μL)、miR-31-5p inhibitor(1μL)、Notch1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(1.2 μL)、Notch1 siRNA(1.5 μL)利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染至原代軟骨細(xì)胞48 h后，給予/不給與IL-1β(5 ng/mL)刺激24 h，然后更換培養(yǎng)，每孔100 μL培養(yǎng)基加入10 μLCCK-8反應(yīng)液，培養(yǎng)2 h后于酶標(biāo)儀測(cè)定，波長(zhǎng)設(shè)定450 nm。

1.3.7 細(xì)胞凋亡測(cè)定 原代軟骨細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度約為40%，將miR-31-5p inhibitor(10 μL)或inhibitor NC(10μL)利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染至原代軟骨細(xì)胞；48 h后收集細(xì)胞，離心后PBS重懸；加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光孵育10 min；再加入10 μL碘化丙啶染液，避光孵育15min，隨后在流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣本分析。

1.3.8 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)在HEK-293T細(xì)胞中進(jìn)行。HEK-293T細(xì)胞接種于96孔板，約5 000個(gè)/孔，將載有野生型Notch1的pGL3(1μL)與miR-31-5p mimics(1μL)、載有突變型Notch1 pGL3(1μL)與miR-31-5p mimics(1μL)、載有野生型Notch1 pGL3(1μL)與mimics NC(1μL)、載有突變型Notch1 pGL3(1μL)與mimics NC(1μL)分別利用Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞內(nèi)，48h后用Bio-GloTM Luciferase Assay System檢測(cè)，分析數(shù)值。

1.3.9 蛋白免疫印跡 收集處理過(guò)的原代軟骨細(xì)胞，用RIPA裂解，BCA法蛋白濃度定量；蛋白樣品用SDS-PAGE凝膠分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜；PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2 h；抗Notch1和β-actin一抗在4度過(guò)夜孵育；TBST洗膜后，用辣根過(guò)氧化物酶耦合的二抗在室溫孵育PVDF膜2 h；ChemDocTM XRS+System儀器進(jìn)行發(fā)光成像，并用Image Lab軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-31-5p在OA下調(diào)表達(dá) 在大鼠術(shù)后6周，我們?nèi)〈笫箨P(guān)節(jié)軟骨，明顯觀察到軟骨面異常損傷(見(jiàn)圖1a)。我們對(duì)sham組和OA組軟骨組織進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，發(fā)現(xiàn)OA模型組軟骨細(xì)胞明顯肥大，并且排列紊亂(見(jiàn)圖1b)。此外，番紅O-固綠染色的結(jié)果顯示，OA模型組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨面出現(xiàn)侵蝕現(xiàn)象(見(jiàn)圖1c)。隨后，我們檢測(cè)大鼠血清的miR-31-5p表達(dá)水平，qRT-PCR結(jié)果顯示，OA模型大鼠血清的miR-31-5p含量低于對(duì)照組(見(jiàn)圖1d)。在軟骨分離的原代細(xì)胞中，OA模型組miR-31-5p的表達(dá)水平同樣低于對(duì)照組(見(jiàn)圖1e)。此外，IL-1β刺激的正常原代軟骨細(xì)胞導(dǎo)致miR-31-5p的表達(dá)顯著下調(diào)(見(jiàn)圖1f)。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，miR-31-5p可能在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。

a 大鼠OA造模的關(guān)節(jié)大體形態(tài)學(xué)改變 b 大鼠OA造模的HE組織染色(HE，×200) c 大鼠OA造模的番紅O-固綠染色(番紅O-固綠，×200)

d miR-31-5p在大鼠血清中的表達(dá) e miR-31-5p在造模后分離的原代軟骨細(xì)胞中的表達(dá) f IL-1β刺激正常原代軟骨細(xì)胞后的miR-31-5p表達(dá)

注：*P<0.01；**P<0.05；***P<0.001

圖1 miR-31-5p在OA下調(diào)表達(dá)結(jié)果

2.2 miR-31-5p調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞生物學(xué)功能 將miR-31-5p mimics轉(zhuǎn)染至正常原代軟骨細(xì)胞，其活力高于轉(zhuǎn)染mimics NC的細(xì)胞(圖2a)；與之相反，miR-31-5p inhibitor導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著降低(圖2b)。這些結(jié)果提示miR-31-5p調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增值能力。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示，miR-31-5p inhibitor增加了細(xì)胞凋亡率(圖2c)。此外，IL-1β抑制軟骨細(xì)胞活力，當(dāng)同時(shí)轉(zhuǎn)染了miR-31-5p mimics后，細(xì)胞活力增加(圖2d)。而miR-31-5p inhibitor會(huì)進(jìn)一步增加IL-1β的抑制作用(圖2e)。此外，我們觀察到OA模型組關(guān)節(jié)軟骨組織的IL-6和MMP-13表達(dá)顯著升高(圖2f～g)。在正常原代軟骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-31-5p inhibitor后，其IL-6和MMP-13的mRNA水平增加(圖2h～i)。這些結(jié)果表明，miR-31-5p不僅影響軟骨細(xì)胞活力，還參與調(diào)節(jié)炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。

a 原代軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-31-5p mimics后的細(xì)胞活力變化 b 原代軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-31-5 pinhibitor后的細(xì)胞活力變化 c 轉(zhuǎn)染miR-31-5 pinhibitor的原代軟骨細(xì)胞的凋亡率

d IL-1β刺激下，正常原代軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-31-5p mimics的活力變化 e IL-1β刺激下，正常原代軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-31-5 pinhibitor的活力變化 f 對(duì)照組和OA組關(guān)節(jié)軟骨組織IL-6的mRNA表達(dá)

g 對(duì)照組和OA組關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-13的mRNA表達(dá) h 轉(zhuǎn)染miR-31-5p inhibitor的原代軟骨細(xì)胞中IL-6的mRNA表達(dá) i 轉(zhuǎn)染miR-31-5p inhibitor的原代軟骨細(xì)胞中MMP-13的mRNA表達(dá)

注：*P<0.05；**P<0.001；***P<0.01

圖2 miR-31-5p調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞生物學(xué)功能

2.3 Notch1是miR-31-5p的直接靶點(diǎn) 我們通過(guò)TargetScanHuman7.2(http：//www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Notch1是miR-31-5p的潛在靶點(diǎn)，而且其結(jié)合位點(diǎn)在脊椎動(dòng)物中高度保守。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，共轉(zhuǎn)染野生型Notch1和miR-31-5p mimics的熒光素酶活性顯著減低(圖3a)。蛋白免疫印跡證實(shí)，轉(zhuǎn)染了miR-31-5p mimics的正常軟骨細(xì)胞，其Notch1的蛋白水平降低(圖3b)。為了證實(shí)Notch1在miR-31-5p下游發(fā)揮作用，我們進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。圖3c的結(jié)果顯示，在IL-1β的作用下，miR-31-5p mimics誘導(dǎo)的細(xì)胞活力增加被共轉(zhuǎn)染的Notch1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒抑制。同樣，在IL-1β的作用下，miR-31-5p inhibitor致使細(xì)胞活力進(jìn)一步降低，可被Notch1 siRNA部分恢復(fù)(圖3d)。

3 討 論

軟骨細(xì)胞是軟骨組織中特有細(xì)胞，有助于維持關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)。大量研究表明，軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡是OA進(jìn)展的關(guān)鍵因素[8-11]。OA常高發(fā)于老年人和關(guān)節(jié)創(chuàng)傷人群[2-3，12]。盡管目前已經(jīng)證實(shí)多種因素，如非編碼RNA、分子信號(hào)通路異常和遺傳等參與OA的發(fā)生發(fā)展，但其具體機(jī)制仍然不明確，為OA的治療帶來(lái)極大不便。miRNAs屬于內(nèi)源性非編碼RNA分子，具有調(diào)控蛋白表達(dá)的作用，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)功能，可作為多種疾病的靶點(diǎn)[5，13]。最近大量研究證實(shí)，不同的miRNAs在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中具有雙向調(diào)節(jié)作用。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-103在OA患者中顯著高表達(dá)；離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-103抑制軟骨細(xì)胞的增殖和成熟，提示miR-103促進(jìn)OA進(jìn)展。另有研究顯示，miR-495在OA患者軟骨中上調(diào)，通過(guò)抑制AKT1/mTOR信號(hào)通路的激活而促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡和老化，進(jìn)而導(dǎo)致OA加重[15]。除了上調(diào)表達(dá)，有些miRNAs在OA中出現(xiàn)低表達(dá)。最近的一項(xiàng)研究揭示，miR-27a在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中呈現(xiàn)下調(diào)，并且與Polo樣激酶2(Polo like kinase 2，PLK2)的表達(dá)負(fù)相關(guān)；增加miR-27a水平可明顯降低PLK2表達(dá)，從而抑制滑膜血管生成和軟骨細(xì)胞凋亡，緩解OA[16]。Guan等[12]發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)的miR-146a與年齡相關(guān)性骨關(guān)節(jié)炎和創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)，過(guò)表達(dá)miR-146a明顯抑制OA的炎性指標(biāo)，并緩解病情加重。而我們的研究表明，OA大鼠模型和IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞模型均顯示miR-31-5p的表達(dá)下降，抑制miR-31-5p導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡增加。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，OA模型組和轉(zhuǎn)染miR-31-5p inhibitor的原代軟骨細(xì)胞中均出現(xiàn)炎癥因子IL-6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-13的表達(dá)上調(diào)。MMP-13促進(jìn)膠原蛋白Ⅱ的降解，加速骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。這些結(jié)果提示，miR-31-5p調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)功能。同時(shí)，我們證實(shí)Notch1在miR-31-5p的下游發(fā)揮作用。

a 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證Notch1是miR-31-5p直接靶點(diǎn) b 轉(zhuǎn)染miR-31-5p mimics后原代軟骨細(xì)胞Notch1的蛋白表達(dá)及灰度分析

c IL-1β刺激下，正常原代軟骨細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-31-5p mimics和Notch1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后的活力變化 d IL-1β刺激下，正常原代軟骨細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-31-5p inhibitor和Notch1 siRNA后的活力變化

注：*P<0.001；**P<0.01；***P<0.05

圖3 Notch1在miR-31-5p下游調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞生物學(xué)行為

Notch1是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡的重要分子。兔OA模型中，Notch1在關(guān)節(jié)軟骨組織中表達(dá)增加，同時(shí)伴有促凋亡分子Bax上調(diào)；抑制Notch1可激活抗凋亡分子Bcl-2[17]。此外，Notch1信號(hào)通路與骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞去分化相關(guān)[18]。Mead等的研究提示，Notch1信號(hào)失活有助于軟骨細(xì)胞增殖，而適度Notch1信號(hào)對(duì)于正常軟骨細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖和肥大軟骨細(xì)胞向骨分化的正常進(jìn)展至關(guān)重要[19]。抑制Notch1導(dǎo)致NF-κB p65向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位減少，以此降低炎癥因子的表達(dá)；同時(shí)，抑制Notch1可拮抗IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，保護(hù)軟骨細(xì)胞不被損傷[20]。我們發(fā)現(xiàn)，Notch1是miR-31-5p的直接靶點(diǎn)，miR-31-5p mimics對(duì)軟骨細(xì)胞的促增殖作用被Notch1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，我們通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)明確miR-31-5p在OA中顯著下調(diào)表達(dá)，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)增加miR-31-5p具有保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了miR-31-5p通過(guò)抑制Notch1實(shí)現(xiàn)其促增殖和抗凋亡的功能。這些結(jié)果初步探討了miR-31-5p在OA進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步明確OA的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。