于凱悅 李唯一 劉宇航 董愛榮 劉薇

摘 要：本文采用高通量測序法，探究短密木霉（Trichoderma brevicompactum）、大豆和咪唑乙煙酸三者分別處理以及共同作用對土壤細菌多樣性和群落結構的影響。試驗以不含上述3種物質的土壤為陰性對照。結果表明：5個不同處理樣品共含有36 336個細菌OTU（operational taxonomic unit），其中共有的細菌種類有1 031個，僅占樣品細菌總數(shù)的2.84%;不同處理土壤樣品的細菌多樣性均發(fā)生變化，短密木霉、大豆對土壤細菌多樣性的影響小于咪唑乙煙酸;不同處理樣品的細菌群落結構組成基本相同，差異較大的是相對豐度。變形菌門（Proteobacteria）是5個樣品中的優(yōu)勢細菌，平均豐度為50.82%;在屬的水平下，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是5個樣品中的優(yōu)勢細菌，其次是芽單胞菌屬（Gemmatimonas）和微小桿菌屬（Exiguobacterium）。結論：土壤中加入短密木霉后，土壤細菌多樣性及物種總數(shù)略微下降;種植大豆后，土壤細菌多樣性及物種總數(shù)升高;加入咪唑乙煙酸后，土壤細菌多樣性及物種總數(shù)顯著降低;短密木霉及大豆對土壤細菌多樣性及物種總數(shù)的影響小于咪唑乙煙酸。

關鍵詞：高通量測序法;短密木霉;咪唑乙煙酸;大豆;多樣性

Abstract：In this paper， high-throughput sequencing was used to investigate the effects of the interactions between Trichoderma brevicompactum， soybean and imazethapyr on soil bacterial diversity and community structure. The soil without the above three substances was used as the negative control. The results showed that： five different treatment samples contained a total of 36 336 bacterial OTUs， of which 1 031 were bacterial species presented in all samples， accounting for only 2.84% of the total bacteria. The bacterial diversity of soil samples under different treatments had changed， and the effect of T. brevicompactum and soybean on soil bacterial diversity was less than that of imazethapyr. The composition of the bacterial community structure was basically the same in different treatment samples， but the relative abundance was very different. Proteobacteria was the dominant bacteria in five samples， with an average abundance of 50.82%; at the genus level， Sphingomonas was the predominant bacterium in the five samples， followed by Gemmatimonas and Exiguobacterium. Conclusion： After adding T. brevicompactum to the soil， the soil bacterial diversity and total species decreased slightly; after planting soybeans， the soil bacterial diversity and total species increased; after adding imazethapyr， the soil bacterial diversity and total species decreased significantly; the effects of T. brevicompactum and soybean on soil bacterial diversity and total species were less than that of imazethapyr.

Keywords：High-throughput sequencing; Trichoderma brevicompactum; imazethapyr; soybean; diversity

0 引言

隨著農業(yè)技術的不斷發(fā)展，農藥的運用逐漸增多，其中，咪唑乙煙酸具有活性高、用量低和選擇性廣等優(yōu)點，在農業(yè)市場中占有重要地位[1]，常用于大豆和苜蓿等豆科作物防除眾多一年生和多年生禾本科雜草及闊葉雜草[2]。咪唑乙煙酸可以在大豆體內快速分解，半衰期僅1～6 d，但其殘留期較長，在施用后3 a內不可種植除大豆以外的作物，尤其以經(jīng)濟作物，如紫蘇、白菜、小麥和甘蔗等最為敏感，會對后茬農作物種植產(chǎn)生嚴重影響[3]，還可能殘留于地下水中，對人們的生活用水造成一定的影響[4]。

目前如果對土壤微生物多樣性方面采用傳統(tǒng)方法（如：平板劃線法或直接稀釋后染色并鏡檢[5]）會存在工作量大培養(yǎng)時間長等缺點[6]，相比較而言，高通量測序法更為準確快捷[7]，同時有利于對實驗室培養(yǎng)條件下容易忽略的低豐度菌群種類進行探究[8-9]。

本研究基于高通量測序法，利用盆栽模擬試驗分析短密木霉、大豆、咪唑乙煙酸單獨及三者相互作用對細菌多樣性和菌落結構的影響，為咪唑乙煙酸的生物降解提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

盆栽試驗土壤按m草炭∶m沙子∶m土=5∶3∶2比例進行混合。大豆品種采用黑農48。實驗采用的菌種短密木霉（Trichoderma brevicompactum）為課題組前期馴化得到的高效降解菌株。分離真菌的培養(yǎng)基采用孟加拉紅培養(yǎng)基[10]。保存菌株采用PDA培養(yǎng)基[11]。

1.2 盆栽試驗

將短密木霉（T. brevicompactum）接種于60個PDA培養(yǎng)皿中，在25 ℃、黑暗條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，待菌株大量產(chǎn)孢后，將菌絲連同孢子刮下，加入到盛有無菌水的燒杯中，放入少量的吐溫80，用玻璃棒充分的攪拌后均勻地混入部分試驗用土壤中，再將已經(jīng)配置好的5%咪唑乙煙酸水劑按照50 mg/kg的質量分數(shù)混入部分實驗土壤。每盆放入15粒均勻、飽滿、無病蟲害的大豆種子，蓋上適量的土，給予適宜的溫度、水分和光照，使其自然生長[12]。

以短密木霉（T. brevicompactum）為降解菌，按表1設計盆栽試驗。試驗組在處理后30 d用五點法取土樣，風干，過10目篩，放入冰箱4 ℃保存待用[13]。

1.3 樣品基因組提取

參照E Z N ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒的使用說明書，提取土壤樣品 DNA，利用Tris鹽酸緩沖液洗脫DNA，并置于-20 ℃ 條件下凍存，送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成16S r RNA 基因擴增子測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

選擇基因序列號為341 F和805 R作為引物，引物序列分別為CCTACGGGNGGCWGCAG和GACTACHVGGGTATCTAATCC，利用Illumina Mi Seq平臺進行測序和分析。下機數(shù)據(jù)經(jīng)過 QIIME（v1.8.0）軟件過濾、拼接和去除嵌合體，去除各樣本中reads尾部質量值在20以下的堿基，切除reads中含N的序列，并去除數(shù)據(jù)中的短序列，長度閾值200 bp，隨后再對低復雜度的序列進行過濾。

采用Usearch （version 7.1）軟件進行數(shù)據(jù)處理，物種比對注釋使用 RDP classifier 軟件，保留置信區(qū)間大于 0.8 的注釋結果。利用Mothur軟件進行Chao1指數(shù)、香農指數(shù)（Shannon）計算分析，并在各分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析，得到微生物群落結構組成。

2 結果與分析

2.1 不同處理樣品的細菌多樣性分析

Shannon指數(shù)是用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，常用于反映alpha多樣性指數(shù)[14]。Shannon值越大，說明微生物多樣性越高。Chao1指數(shù)在生態(tài)學中常用來估計物種總數(shù)[15]。對5個不同處理樣品的OTU（operational taxonomic unit）數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)進行比較分析，結果見表2。由表2可知，不同處理樣品分別檢測到7 653、7 478、7 682、6 571、6 952個細菌OTU，跟CK相比，樣品A1的OTU數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)略微下降，說明土壤加入短密木霉后，對其他微生物產(chǎn)生一定的抑制作用，土壤細菌多樣性及物種總數(shù)略微下降;樣品A2的OTU數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)最高，在一定程度上說明種植大豆后，土壤細菌多樣性及物種總數(shù)升高;樣品A3的OTU數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)最低，說明咪唑乙煙酸對土壤細菌多樣性及物種總數(shù)影響很大;樣品A4的OTU數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均高于樣品A3，說明三者互作中，添加短密木霉及大豆后咪唑乙煙酸對土壤細菌多樣性及物種總數(shù)影響在一定程度上減少。一方面由于短密木霉降解部分咪唑乙煙酸，降低土壤中咪唑乙煙酸的濃度，同時大豆的種植對土壤細菌多樣性及物種總數(shù)的積極影響，使三者相互作用，對土壤細菌多樣性及物種總數(shù)影響小于單獨添加咪唑乙煙酸。而樣品4和樣品3的Shannon指數(shù)相近，Chao1指數(shù)卻相差很大，這是由于處理組之間物種種類雖多，但物種分布不均勻。

2.2 不同處理樣品的細菌群落結構差異性分析

由圖2可知，從微生物分類的門水平上來看，5個樣品主要含有10個門的細菌，包括：變形菌門（Proteobacteria ）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）、檢菌總門（Parcubacteria）。在門水平下，不同處理樣品的細菌群落結構組成基本相同，差異較大的是相對豐度。這也說明土壤樣品經(jīng)過不同處理后，群落結構不會發(fā)生根本改變。變形菌門（Proteobacteria）是5個樣品中的優(yōu)勢細菌，其中，A4樣品的豐度最大，為58.45%，A2樣品的豐度最小，為42.89%。其次是酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），平均豐度分別為10.74%、10.46%。其他門以及未鑒定的細菌平均豐度均在5%以下。

根據(jù)物種分類結果，由于樣品中所檢測出的微生物種類繁多，許多物種含量相對較少，因此選擇細菌豐度前20的物種進行分類統(tǒng)計，如圖3所示。由圖3可知，從微生物分類的屬水平角度來看，5個樣品豐度前20個屬的細菌有：鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、Gaiella、Rhizomicrobium、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、Phenylobacterium、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、Rhodoferax、Rudaea、溶桿菌屬（Lysobacter）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、產(chǎn)卟啉桿菌屬（Porphyrobacter）、Methylophilus、不動桿菌屬（Acinetobacter）、類諾卡氏屬（Nocardioides）、孢魚菌屬（Sporichthya）、假單胞菌（Pseudomonas）及德沃斯氏菌屬（Devosia）。在屬水平下，不同處理樣品的細菌群落結構組成基本相同，差異較大的是相對豐度。鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是5個樣品中的優(yōu)勢細菌，其中，A3樣品的豐度最大，為11.09%，其次是A4樣品，豐度為9.31%，CK樣品的豐度最小，為6.1%。鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）細菌可用于芳香化合物的生物降解，加入咪唑乙煙酸后，可能促進了鞘氨醇單胞菌屬細菌的增殖。其次是芽單胞菌屬（Gemmatimonas），平均豐度為6.86%，而后是微小桿菌屬（Exiguobacterium），平均豐度為5.96%，而其他前20屬細菌平均豐度均在5%以下，其余已鑒定屬合計平均豐度38.7%，占很大比例。

3 討論與結論

本研究表明，土壤中加入短密木霉后，土壤細菌多樣性及物種總數(shù)略微下降，這與李雪萍的實驗結果相似[17];種植大豆后，土壤細菌多樣性及物種總數(shù)升高，這與張健的研究結果相一致[18];加入咪唑乙煙酸后，土壤細菌多樣性及物種總數(shù)顯著降低，這與戎麗麗的實驗結論一致[19]?？偟膩碚f短密木霉及大豆對土壤細菌多樣性及物種總數(shù)的影響小于咪唑乙煙酸。

不同處理樣品中的細菌群落結構組成基本相同，差異較大的是相對豐度。在門水平下，變形菌門（Proteobacteria ）是5個樣品中的優(yōu)勢細菌，其次是酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。在屬的水平下，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是5個樣品中的優(yōu)勢細菌，其次是芽單胞菌屬（Gemmatimonas）和微小桿菌屬（Exiguobacterium）。

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