張遠遠，胡昌華，楊書紅，王 崢

(1.武漢科技大學附屬漢陽醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430000； 2.華中科技大學附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430000； 3. 荊州市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 荊州 434000)

卵巢作為維系女性健康的生殖器官，行使著生殖及內(nèi)分泌的功能。受遺傳、環(huán)境和行為等因素的影響，女性卵巢功能逐漸衰退，激素調(diào)節(jié)失衡，進而導致機體如骨骼、心血管及免疫等多器官、系統(tǒng)的功能障礙。卵巢功能減退表現(xiàn)為女性在40歲以前出現(xiàn)的月經(jīng)異常、促性激素水平升高及雌激素水平波動性降低，隨病情加重，出現(xiàn)閉經(jīng)、雌激素水平降低等癥狀，以致卵巢早衰[1]。在我國，卵巢早衰的發(fā)病率為1%，其中90%～95%的患者無法自然妊娠，嚴重影響了女性的身體健康及生活質(zhì)量。目前，臨床根據(jù)癥狀和患者對生育的不同需求，常使用激素替代療法、免疫治療和中藥治療等方法恢復排卵以受孕，但尚無有效的方法能夠恢復卵巢功能[2]。卵巢顆粒細胞 (granulosa cell，GC)是卵巢合成和分泌雌激素、抑制素的主要功能細胞，其在卵泡細胞的成熟和發(fā)育中起著支持雌激素介導作用，同時維持卵巢激素平衡[3]。GC的凋亡啟動卵泡發(fā)生閉鎖，使有正常生理功能的卵泡數(shù)目大幅減少，從而導致卵巢早衰[4-5]。CRKL是CRK蛋白家族中的重要成員，可以促進并調(diào)節(jié)細胞增殖、黏附和遷移等多種生物學功能。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Crk和CrkL蛋白可能在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮某種作用[6]，可能成為細胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在新型診斷標志物和治療靶點。微RNA (microRNA，miRNA)是由19～25個核苷酸構(gòu)成的非編碼單鏈小RNA分子，在動植物及微生物中都廣泛存在，其通過對信使RNA進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使其表達沉默，進而影響細胞的生長、發(fā)育、分化及凋亡。有報道稱，無論物種如何，miRNA-21、miRNA-99a、miRNA-125b、miRNA-126、miRNA-143、miRNA-145和miRNA-199b都是最常見的卵巢miRNA群[5]。該類小分子參與調(diào)節(jié)卵巢顆粒細胞的增殖、凋亡等多種功能[5]，在卵巢激素生成、卵泡生長發(fā)育及排卵方面都發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[7]。但miRNA如何調(diào)控顆粒細胞激素的合成及通過何種途徑影響顆粒細胞的凋亡等功能，值得進一步探討。本研究預備采用miRNA芯片技術(shù)檢測在不同時期小鼠卵巢顆粒細胞中差異性表達的miRNA，采用生物信息學軟件TargetScan預測具有顯著差異性表達的miRNA靶基因，分析靶基因在信號通路及生物學功能的富集情況，篩選與CRKL存在最佳堿基互補的miRNA，結(jié)合生物信息預測結(jié)果，篩選在不同時期卵巢顆粒細胞中起到重要調(diào)控作用的miRNA；調(diào)查其在體內(nèi)、體外對激素生成及細胞增殖的影響，分析CRKL在卵巢顆粒細胞中是否受關鍵miRNA的調(diào)控，從而對關鍵信號通路產(chǎn)生影響，為顆粒細胞凋亡引發(fā)的卵巢早衰的防治提供新的治療靶點依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠miRNA寡核苷酸基因芯片12.0、miRNA Complete Labeling and Hyb Kit及Gene Expression Wash Buffer Kit均購自美國安捷倫公司；miRVana RNA提取試劑盒購自Ambion公司；RNase-Free DNase Set (50)購自Qiagen公司；RNA提取試劑Trizol購自Gibco BRL公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo (dT)購自Promega公司；Taq DNA聚合酶購自MBI公司；RNA酶抑制劑RNasin購于Sigma公司；DMEM/F12購自美國Gibco公司；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma公司；青鏈霉素混合液購自索萊寶公司；本研究所有基因引物均購自上海生工公司；CRKL酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?；雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)ELISA試劑盒購自上海西唐公司；p-p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)及p-蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)ELISA檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。DAVID數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址(https://david.ncifcrf.gov/，版本號6.8)，TargetScan數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址(http://www.targetscan.org/vert_72/)。

1.2 實驗動物的藥物干預及處理

C57BL/6小鼠購自湖北疾控中心，miRNA-145敲除的C57BL/6小鼠購自賽業(yè)生物科技有限公司，飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心SPF級動物房。小鼠接受自由飲食飲水，控制日夜周期，雌雄性小鼠在各品種內(nèi)自由交配。5日齡乳鼠卵巢內(nèi)出現(xiàn)初級卵泡，遂分別選取5日齡小鼠及14日齡小鼠進行指標的檢測。將初生雌鼠分為A組(5日齡正常雌鼠)、B組 (5日齡miRNA-145敲除小鼠)、C組(14日齡正常雌鼠)和D組 (14日齡miRNA-145敲除小鼠)。

1.3 5、14日齡雌鼠卵巢顆粒細胞的提取、培養(yǎng)及生存率檢測

(1)DMEM/F12培養(yǎng)液：胎牛血清與DMEM/F12混合比例為1∶9，并且加入1%體積的青霉素和鏈霉素。無菌操作，密封后4 ℃保存。Ⅰ型膠原酶：Ⅰ型膠原酶0.1 g與PBS 100 ml充分混勻，濾過除菌后分裝，置于-20 ℃保存。(2)分別于5、14 d對四組小鼠進行解剖，取出雙側(cè)卵巢，分離卵巢周圍多余脂肪及卵巢囊，根據(jù)文獻方法[8]，提取卵巢顆粒細胞，將不同組小鼠的卵巢顆粒細胞分別接種于4個培養(yǎng)瓶中，置于DMEM/F12培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO2和濕度90%的孵箱孵育。12 h換液1次，24 h傳代1次。體外培養(yǎng)72 h后分別加入miRNA-145抑制劑2 μmol/L繼續(xù)培養(yǎng)72 h。(3)細胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，在每孔液面上加入5 mg/ml的MTT 20 μl，37 ℃溫箱中孵育4 h后取出培養(yǎng)板，小心抽去上清液，結(jié)晶用DMSO 150 μl溶解，在平板振蕩器上振蕩10 min，使用Thermo 3001型多功能酶標儀570 nm處測量各孔的吸光值，計算藥物對細胞活力的影響：

1.4 Q-PCR檢測miRNA-145及CRKL mRNA的表達

采用試劑盒提取細胞RNA，反應體系為 2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，Primer A 1 μl，Primer B 1 μl，cDNA 2 μl，RNase-free water 6 μl，Total reaction volume 20 μl。反應條件為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s。循環(huán)擴增 40 次結(jié)束后，獲得miRNA-145及CRKL mRNA循環(huán)閾值 (cycle threshold，Ct)，應用ΔΔCt (ΔCt目的基因-ΔCt 內(nèi)參基因)分析，計算2-ΔΔCt目的基因相對表達量之后，進行統(tǒng)計分析。

1.5 ELISA法檢測雌鼠血清中E2、FSH和LH水平及卵巢顆粒細胞中CRKL、p-p38 MAPK和p-ERK1/2水平變化

(1)將各組小鼠解剖后，進行眼眶取血，離心后留上清液，根據(jù)試劑盒檢測方法對E2、FSH、LH的水平進行檢測。(2)各組小鼠解剖后，取出卵巢組織，分離卵巢細胞，采用文獻的方法提取細胞全蛋白[9]，根據(jù)試劑盒檢測方法對卵巢顆粒細胞中CRKL、p-p38 MAPK及p-ERK1/2的水平進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 5、14日齡小鼠卵巢中差異性表達miRNA分析及關鍵miRNA的篩選

根據(jù)miRNA在不同組間的表達量的差異，5日齡與14日齡小鼠卵巢顆粒細胞中miRNA相比，15個miRNA表達明顯上調(diào)；9個miRNA表達明顯下調(diào)[見圖1(A)]；隨后采用TargetScan數(shù)據(jù)庫預測有明顯差異性表達的miRNA的靶基因，并對靶基因集合進行KEGG通路富集及GO-BP分析，結(jié)果顯示，差異性表達miRNA對應靶基因多集中于MAPK信號通路及NOD樣受體信號通路，且其生物學功能多與細胞的增殖、分化及形態(tài)有關[見圖1(B、C)]，提示miRNA可能通過影響細胞的增殖分化等過程影響小鼠卵巢的發(fā)育。經(jīng)TargetScan數(shù)據(jù)庫預測與CKRL蛋白堿基互補的miRNA。結(jié)合miRNA在不同日齡小鼠卵巢中表達的差異、其靶蛋白所涉及的生物學功能及與CRKL堿基互補情況結(jié)果，預測miRNA-145可能通過與CRKL結(jié)合(見表1)，從而影響卵巢細胞的增殖及激素合成，同時發(fā)現(xiàn)CRKL在富集于MAPK通路的分子集中。為驗證預測結(jié)果，本課題組將在體外試驗中研究miRNA-145是否通過靶向CRKL影響其增殖及激素合成情況。

A.差異性表達miRNA聚類分析熱圖；B.差異性表達miRNA靶基因通路富集分析；C.差異性表達miRNA靶基因生物學功能富集分析A.heat map of differential expression miRNA cluster analysis; B.pathway enrichment analysis of differential expression miRNA target gene; C.biological function enrichment analysis of differential expression miRNA target genes

2.2 miRNA-145、CRKL mRNA在5、14日齡小鼠卵巢顆粒細胞中及miRNA-145抑制劑作用后的表達

對不同日齡雌鼠的卵巢中miRNA-145及CRKL mRNA的表達情況進行對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5日齡小鼠卵巢中miRNA-145表達與14日齡雌鼠卵巢中miRNA-145相比有顯著性降低[見圖2(A)]。而CRKL mRNA表達水平結(jié)果顯示，5日齡小鼠卵巢中CRKL mRNA表達與14日齡雌鼠卵巢中CRKL mRNA相比同樣有顯著性降低，證明CRKL mRNA與miRNA-145表達呈正相關[見圖2(B)]。MTT法檢測各組卵巢顆粒細胞的生存率結(jié)果提示[見圖2(C)]，卵巢顆粒細胞在正常生理環(huán)境下衰老凋亡速度較慢，但抑制miRNA-145的表達后，細胞生存率明顯升高，miRNA-145能夠加速細胞的衰老乃至凋亡。同時檢測了miRNA-145抑制劑對不同生長時期卵巢顆粒細胞中CRKL mRNA水平的影響[見圖2(D)]，結(jié)果顯示，miRNA-145抑制劑能夠明顯降低各組細胞的CRKL mRNA水平。

2.3 miRNA-145敲除小鼠卵巢激素分泌正向調(diào)節(jié)，顆粒細胞內(nèi)CRKL水平下調(diào)

POF的診斷標準之一就是促性腺激素水平升高，伴雌激素水平降低[5]。根據(jù)結(jié)果[見圖3(B、C、D)]，14日齡基因敲除小鼠與14日齡正常組小鼠相比，F(xiàn)SH及LH水平明顯降低，E2水平顯著性升高。miRNA-145敲除后小鼠卵巢與正常小鼠卵巢中相比，CRKL水平顯著性降低[見圖3(A)]，與體外實驗結(jié)果一致。

2.4 miRNA-145敲除小鼠的卵巢顆粒細胞p-p38 MAPK，p-ERK1/2蛋白表達下調(diào)

經(jīng)統(tǒng)計學對比后發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠的卵巢顆粒細胞中p-p38 MAPK及p-ERK1/2水平與正常組小鼠比較顯著降低[見圖4(A、B)]，提示miRNA-145的表達受到抑制后，MAPK信號通路的激活同樣受到抑制，從而使卵巢顆粒細胞的凋亡明顯下降。

表1 CRKL與miRNA-145堿基配對情況

5D：5日齡雌鼠卵巢顆粒細胞；14D：14日齡雌鼠卵巢顆粒細胞; A.miRNA-145在5、14日齡小鼠卵巢顆粒細胞中的表達(與5D相比，*P<0.05，**P<0.01)；B.CRKL mRNA在5、14日齡小鼠卵巢顆粒細胞中的表達(與5D相比，*P<0.05，**P<0.01)；C.miRNA-145抑制劑對5、14日齡小鼠卵巢顆粒細胞生存率的影響(與A組相比，*P<0.05，**P<0.01)；D.miRNA-145抑制劑對5、14日齡小鼠卵巢顆粒細中CRKL mRNA表達的影響(與A組相比，*P<0.05，**P<0.01；與C組相比，#P<0.05，##P<0.01)5D: ovarian granulosa cells of 5-day-old female mice, 14D: ovarian granulosa cells of 14-day-old female mice; A. expression of miRNA-145 in ovarian granulosa cells of 5-day-old and 14-day-old mice (vs. 5 D, *P<0.05, **P<0.01); B. expression of CRKL mRNA in ovarian granulosa cells of 5-day-old and 14-day-old mice(vs. 5 D, *P<0.05, **P<0.01); C. effect of miRNA-145 inhibitor on the survival rate of ovarian granulosa cells in 5-day-old and 14-day-old mice (vs. group A, *P<0.05, **P<0.01); D. effect of miRNA-145 inhibitor on the expression of CRKL mRNA in ovarian granules of 5-day-old and 14-day-old mice (vs. group A, *P<0.05, **P<0.01; vs. group C, #P<0.05, ##P<0.01)

3 討論

目前認為，卵巢衰老的主要原因是卵泡數(shù)目減少、卵巢微環(huán)境的改變以及對外界刺激的反應力降低，其中卵泡數(shù)目的減少是最主要的衰老病因，而卵泡數(shù)目的減少與卵泡閉鎖密切相關[10]。在女性一生中，發(fā)育成熟并能夠最終被釋放的卵泡數(shù)目是有限的，但卵巢衰老后，隨著卵泡閉鎖以致消亡會導致卵巢功能最終喪失，激素分泌、調(diào)節(jié)失衡，引發(fā)機體其他系統(tǒng)或器官的病變[11]。引發(fā)卵泡閉鎖的重要環(huán)節(jié)是卵巢顆粒細胞的凋亡[12]。miRNA是一類可調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平基因表達的小分子非編碼RNA，在卵巢激素的生成、卵泡生長發(fā)育、排卵以及黃體功能形成過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[13]。大量有關miRNA的研究集中于其對腫瘤細胞的調(diào)節(jié)作用，罕見對機體正常功能細胞的生長、分化及功能的研究。本研究采用miRNA 芯片技術(shù)檢測了5、14日齡雌性小鼠卵巢中差異性表達的miRNA共23個，隨后通過對miRNA靶基因的生物學功能及通路的富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路是不同日齡小鼠的卵巢顆粒細胞在增殖等過程中的重要信號通路，與相關研究結(jié)果一致[14]，這也就間接提示，miRNA可能通過影響細胞的增殖分化等過程影響小鼠卵巢的發(fā)育。經(jīng)TargetScan數(shù)據(jù)庫與CRKL堿基互補良好的miRNA，同時結(jié)合生物信息學結(jié)果，預測miRNA-145可能通過與CRKL靶向結(jié)合，從而影響卵巢細胞的增殖及激素合成。

Nor 14D：14日齡雌鼠卵巢顆粒細胞；miRNA-145 -/- 14D：14日齡miRNA-145敲除小鼠卵巢顆粒細胞; A.CRKL在14日齡正常小鼠與14日齡miRNA-145敲除小鼠卵巢細胞中的表達(與Nor 14 D相比，#P<0.05，##P<0.01)；B.E2在14日齡正常小鼠與14日齡miRNA-145敲除小鼠卵巢細胞中的表達(與Nor 14 D相比，#P<0.05，##P<0.01)；C.FSH在14日齡正常小鼠與14日齡miRNA-145敲除小鼠卵巢細胞中的表達(與Nor 14 D相比，#P<0.05，##P<0.01)；D.LH在14日齡正常小鼠與14日齡miRNA-145敲除小鼠卵巢細胞中的表達(與Nor 14 D相比，#P<0.05，##P<0.01)Nor 14D: ovary granulosa cells of 14-day-old female mice; miRNA-145-/-14D: ovary granulosa cells of 14-day-old miRNA-145 knockout mice; A.expression of CRKL in ovary of 14-day-old normal mice and 14-day-old miRNA-145 knockout mice (vs. Nor 14 D, #P<0.05, ##P<0.01); B. expression of E2 in ovary of 14-day-old normal mice and 14-day-old miRNA-145 knockout mice (vs. Nor 14 D, #P<0.05, ##P<0.01); C. expression of FSH in ovary of 14-day-old normal mice and 14-day-old miRNA-145 knockout mice (vs. Nor 14 D, #P<0.05, ##P<0.01); D. expression of LH in ovary of 14-day-old normal mice and 14-day-old miRNA-145 knockout mice (vs. Nor 14 D, #P<0.05, ##P<0.01)

Nor 14D：14日齡雌鼠卵巢顆粒細胞；miRNA-145 -/- 14D：14日齡miRNA-145敲除小鼠卵巢顆粒細胞; A.p-P38-MAPK在14日齡正常小鼠與14日齡miRNA-145敲除小鼠卵巢細胞中的表達(與Nor 14D相比，#P<0.05，##P<0.01)；B.p-ERK 1/2在14日齡正常小鼠與14日齡miRNA-145敲除小鼠卵巢細胞中的表達(與Nor 14D相比，#P<0.05，##P<0.01)Nor 14D: ovary granulosa cells of 14-day-old female mice; miRNA-145-/-14D: ovary granulosa cells of 14-day-old miRNA-145 knockout mice; A.expression of p-P38-MAPK in ovary of 14-day-old normal mice and 14-day-old miRNA-145 knockout mice (vs. Nor 14D, #P<0.05, ##P<0.01); B.expression of p-ERK 1/2 in ovary of 14-day-old normal mice and 14-day-old miRNA-145 knockout mice (vs. Nor 14D, #P<0.05, ##P<0.01)

有研究結(jié)果證明，CRKL通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達以及激活ERK通路，提高肺癌細胞侵襲能力[15]。針對結(jié)腸癌的研究結(jié)果表明，CRKL在結(jié)腸癌中的表達顯著高于正常組織，促進細胞增殖、遷移和侵襲，同時抵抗細胞凋亡，提示CRKL的上調(diào)會促進細胞的生長增殖行為[16]。為驗證預測結(jié)果，本研究分別提取了5、14日齡雌鼠的卵巢顆粒細胞，對不同日齡雌鼠的卵巢中miRNA-145及CRKL mRNA的表達情況進行對比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨年齡增長，卵巢發(fā)育，卵巢顆粒細胞中相關蛋白開始改變，miRNA-145表達的差異可能是卵巢發(fā)育乃至衰老的一個持續(xù)性變化RNA。而CRKL mRNA與miRNA-145表達呈正相關，證明CRKL與細胞的發(fā)育、分化等有關。

在卵巢中，F(xiàn)SH、LH受體與顆粒細胞狀態(tài)呈現(xiàn)相關性，卵泡閉鎖和顆粒細胞凋亡會導致FSH和LH受體表達降低[17]。研究結(jié)果表明，F(xiàn)SH的增加可減緩顆粒細胞的凋亡速度，激素水平的調(diào)節(jié)及卵巢功能失衡是卵巢早衰的重要診斷之一[18]。本研究對比14日齡小鼠激素水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，基因敲除小鼠FSH及LH水平明顯降低，E2水平顯著性升高，證明miRNA-145敲除后，小鼠卵巢中激素分泌水平受到影響，抑制miRNA-145的表達可以延緩小鼠卵巢衰老的進程。體外miRNA-145抑制劑對不同生長時期小鼠卵巢顆粒細胞生存率及CRKL mRNA水平的影響提示，CRKL水平與miRNA-145水平呈正相關，推測miRNA-145受到抑制后，表達下調(diào)，CRKL水平降低，從而提升細胞生存率；根據(jù)miRNA-145敲除小鼠miRNA-145抑制后14日齡小鼠卵巢中CRKL水平可見，miRNA-145敲除后小鼠卵巢與正常小鼠卵巢相比，CRKL水平顯著性降低。以上研究結(jié)果提示，miRNA-145可能通過靶向CRKL對卵巢顆粒細胞的功能及生存率產(chǎn)生影響，而生物信息預測結(jié)果提示，MAPK通路可能是重要的機制之一。

MAPK信號通路在多種生物和細胞中具有重要調(diào)控作用，參與機體生長、發(fā)育等多種生物學過程[19]。在卵巢顆粒細胞中MAPK信號通路參與細胞增殖、分化及氧化應激等多種過程[20]。MAPK家族的信號通路主要由4條途徑組成，包括p-p38 MAPK、蛋白激酶 (ERK)、c-Jun N端激酶應激激活的蛋白激酶和ERK5/BMK1[21]。其中p-p38 MAPK作為研究最多也最透徹的信號轉(zhuǎn)導途徑，影響著細胞生長、分化、增殖和凋亡等一系列生物過程[22]。經(jīng)生物信息學預測，miRNA-145可能通過靶向CRKL對MAPK產(chǎn)生作用，從而影響卵巢顆粒細胞的生存率及生物學功能。在體實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-145基因敲除后，與正常組小鼠對比，p-p38 MAPK、p-ERK1/2蛋白表達水平明顯降低，提示miRNA-145能夠調(diào)控MAPK信號通路，通過抑制miRNA-145的表達，可抑制MAPK通路的激活，減少卵巢顆粒細胞的凋亡。

miRNA-145表達受抑制后，卵巢顆粒細胞的生存率得到保護，凋亡減少，激素分泌水平趨于平衡，其機制與MAPK通路有關，而其中關鍵的作用蛋白可能是與miRNA-145靶向結(jié)合的CRKL。

綜上所述，本研究采用生物信息學方法預測miRNA-145是卵巢早衰中的重要轉(zhuǎn)錄因子，且與CRKL能夠靶向結(jié)合；體外實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-145抑制劑可減少卵巢顆粒細胞的凋亡，并抑制CRKL水平；在體實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-145敲除小鼠的CRKL表達減少，激素分泌水平趨于平衡，這與抑制MAPK通路的激活有關。miRNA-145抑制劑靶向CRKL調(diào)節(jié)MAPK通路可能是卵巢早衰的診治新思路。