吳 宇 葉 金 李 麗 何建洪 張 峰 李 森 軒志宏 崔 華 王松雪 馬海華

(糧油質(zhì)量安全研究所；國家糧食與物資儲備局科學(xué)研究院1，北京 100000) (?？苾x器(廈門)有限公司2，廈門 361000) (河南工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院3，鄭州 450000)

葉金，男，1988年出生，助理研究員，糧油質(zhì)量安全檢測

玉米赤霉烯酮是由鐮刀菌產(chǎn)生的具有類雌激素作用的一類真菌毒素[1]，廣泛存在于玉米、小麥、高粱等糧谷類作物中。誤食玉米赤霉烯酮會產(chǎn)生急慢性中毒，如動物雌激素水平提高，動物流產(chǎn)、死胎、畸形等生殖異常，還具有肝毒性、免疫毒性及細胞毒性等[2-4]。玉米赤霉烯酮的污染受到世界各國的重視，GB/T 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[5]規(guī)定了玉米、小麥中玉米赤霉烯酮最高限量為60 μg/kg。

目前，國內(nèi)外檢測玉米赤霉烯酮的方法主要有薄層色譜法[6]、免疫親和層析熒光光度法[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8]、免疫膠體金快速測定法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10,11]、高效液相色譜法[12-14]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]等。薄層色譜法檢測步驟煩瑣，重現(xiàn)性差，靈敏度低。免疫親和層析熒光光度法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金試紙條法屬于快檢方法，適用于糧庫、企業(yè)等收糧過程的簡單篩查。高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法適用于實驗室內(nèi)精確定量。但現(xiàn)有普遍使用的免疫親和柱層析高效液相色譜法存在前處理復(fù)雜、耗時長，人為因素引入誤差和錯誤的風(fēng)險高，對人員技術(shù)水平要求高，人員暴露在真菌毒素和試劑污染環(huán)境中時間長的問題。

本研究將針對免疫親和柱層析高效液相色譜法檢測真菌毒素存在的弊端，結(jié)合全自動固相萃取技術(shù)，開發(fā)自動免疫親和柱凈化-高效液相色譜檢測糧油中真菌毒素的方法，系統(tǒng)考察其方法性能，并與國標(biāo)方法進行對比。本方法簡單、快速、通量高適用于大批量糧油中玉米赤霉烯酮的精準(zhǔn)測定，將為糧油中玉米赤霉烯酮檢測和污染風(fēng)險評估工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Fotector Plus全自動固相萃取儀；I-Class高效液相色譜儀；AutoEVA-60全自動濃縮氮吹儀；甲醇、乙腈；PBS鹽包、吐溫-20；超純水；Evergreen TREA玉米赤霉烯酮免疫親和柱； 國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)甲醇中玉米赤霉烯酮[GBW(E)100301]，玉米全粉玉米赤霉烯酮成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)100385]，質(zhì)控樣品全麥粉中玉米赤霉烯酮、玉米油中玉米赤霉烯酮、大米粉中玉米赤霉烯酮、玉米全粉空白。

1.2 儀器條件

色譜條件：Waters BEH-C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱溫：35 ℃；流動相:乙腈∶水∶甲醇(46∶46∶8)等梯度洗脫。流速為0.2 mL/min，進樣量為10 μL。激發(fā)波長303 nm；發(fā)射波長440 nm。

1.3 樣品前處理方法

全自動固相萃取前處理法：準(zhǔn)確稱取(5±0.01)g樣品，加入20 mL 90%乙腈水，渦旋提取20 min，7 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液加入20 mL 0.1%吐溫-20的PBST緩沖液，7 000 r/min離心5 min，取10 mL過濾液于50 mL離心管內(nèi)，置于80 mL上樣架上，運行編好的儀器方法對樣品進行自動凈化(具體步驟詳見表1，序號1-2進行管路清洗，防止之前樣品污染；序號3進行樣品液過柱，序號4進行親和柱淋洗，序號5-7進行淋洗液排空、親和柱吹干；序號8用甲醇對管路進行置換，防止淋洗液殘留影響洗脫效果，序號9-11進行親和柱洗脫，并在收集盤進行收集)。將洗脫液轉(zhuǎn)移到全自動氮吹儀內(nèi)于55 ℃以下氮氣吹干，用1.0 mL流動相溶解殘渣，供液相色譜測定。

GB 5009.209—2016前處理方法：稱取(40.0±0.1)g粉碎試樣于均質(zhì)杯中，加入4 g氯化鈉和100 mL 90%乙腈水，以均質(zhì)器高速攪拌提取2 min，定量濾紙過濾。移取10.0 mL濾液加入40 mL水稀釋混勻，經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清，濾液備用。將免疫親和柱連接于玻璃注射器下，準(zhǔn)確移取10.0 mL(相當(dāng)于0.8 g樣品)中的濾液，注入玻璃注射器中。 將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以1～2滴/s的流速緩慢通過免疫親和柱，直至有部分空氣進入親和柱中。 用5 mL水淋洗柱子1次，流速為1～2滴/s，直至有部分空氣進入親和柱中，棄去全部流出液。準(zhǔn)確加入1.5 mL甲醇洗脫，流速約為1滴/s。 收集洗脫液于玻璃試管中，于55 ℃以下氮氣吹干后，用1.0 mL流動相溶解殘渣，供液相色譜測定。

表1 全自動固相萃取步驟

2 結(jié)果與討論

2.1 上樣流速優(yōu)化

為了縮短上樣時間，同時保證毒素全部吸附到免疫親和柱上，考察玉米基質(zhì)加標(biāo)稀釋液在上樣流速為1、2、3、4、5 mL/min時的柱回收率，結(jié)果如圖1所示，流速為1～5 mL/min時，回收率在95.8%～100.7%，RSD在1.7%～6.2%，均符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求。但是4 mL/min時開始回收率有一定的下降趨勢，因此選擇3 mL/min的流速，即保證時效性又保證回收率最佳。

圖1 上樣流速對ZEN回收率的影響

2.2 氣推次數(shù)的優(yōu)化

氣推程序通過快速加壓將柱子內(nèi)殘留的液體排出，淋洗之后，柱子內(nèi)的殘留液體是否排干會影響氮吹的時間以及洗脫效果，因此需要對氣推次數(shù)進行優(yōu)化，以確保柱子吹干，結(jié)果如圖2所示，以80 mL/min流速氣推3次后柱子質(zhì)量變化不顯著，說明氣推3次后柱子已吹干。

圖2 氣推次數(shù)對柱子吹干情況的影響

2.3 方法線性、檢出限及定量限

按照逐級稀釋法配制玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照樣品前處理方法對空白樣品進行處理獲得空白基質(zhì)液，采用空白基質(zhì)液逐級稀釋方法獲得玉米赤霉烯酮的檢出限(LOD，S/N≥3)和定量限(LOQ，S/N≥10)。結(jié)果見圖3，玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)為0.999 5，檢出限為7 μg/kg，定量限為20 μg/kg，均滿足日常檢測需要。

圖3 玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 日內(nèi)精密度及回收率

采用本方法和國標(biāo)方法GB 5009.209—2016分別對配制的高、中、低三個濃度梯度的玉米加標(biāo)樣品進行雙試驗檢測，結(jié)果見圖4，GB 5009.209—2016和本方法的回收率在99.0%～112.5%，RSD值在

圖4 本方法和國標(biāo)方法在玉米樣品中加標(biāo)回收率對比

1.5%～3.2%范圍內(nèi)，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求。采用配對t檢驗法比較兩種方法的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異，30 μg/kg的td=0.22，60 μg/kg的td=1.84, 120 μg/kg的td=1.95，均小于查表所得的t0.05,5=2.57，說明測定結(jié)果與國標(biāo)方法無顯著性差異。

2.5 日間精密度及回收率考察

分別采用本方法和國標(biāo)方法每3 h測定中濃度加標(biāo)樣品一次，連續(xù)測定18次，結(jié)果見圖5，國標(biāo)方法的日間平均回收率為105.6%，日間標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.3%，全自動固相萃取儀的日間平均回收率為104.2%，日間標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%均滿足國標(biāo)規(guī)定的回收率和穩(wěn)定性要求。按照GB/T 4889—2008《數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和解釋 正態(tài)分布均值和方差的估計與檢驗》中7.1單總體方差或標(biāo)準(zhǔn)差檢驗實施X2分布檢驗，判斷該方法重復(fù)性測定標(biāo)準(zhǔn)偏差是否超過標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求，同時采用18次極差與現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的18次測定重復(fù)性臨界極差進行對照，考察該方法的重現(xiàn)性。結(jié)果表明，本方法的重復(fù)性測定標(biāo)準(zhǔn)差和18次測定極差均未超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的精密度要求，穩(wěn)定性滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

圖5 本方法和國標(biāo)法連續(xù)測定18次的加標(biāo)回收率

2.6 臺間差考察

為了考察儀器的穩(wěn)定性，隨機選擇兩臺設(shè)備分別對全麥粉玉米赤霉烯酮、玉米油玉米赤霉烯酮、大米粉玉米赤霉烯酮質(zhì)控樣品進行雙試驗檢測，結(jié)果見圖6。采用配對t檢驗法比較兩臺設(shè)備的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異，兩臺儀器測定全麥粉玉米赤霉烯酮的td為0.578 7，玉米油玉米赤霉烯酮的td為0.997 2，大米粉玉米赤霉烯酮的td為1.753 4，均小于查表值t0.05,5為2.570 6，因此兩臺儀器不存在顯著性差異。

圖6 2臺儀器對3種質(zhì)控物質(zhì)的測定結(jié)果

2.7 方法的準(zhǔn)確性考察

使用兩臺設(shè)備對玉米全粉玉米赤霉烯酮成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)100385]、全麥粉玉米赤霉烯酮、玉米油玉米赤霉烯酮、大米粉玉米赤霉烯酮進行檢測。結(jié)果見表2，儀器1和儀器2所有結(jié)果均落在有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考物質(zhì)賦值范圍內(nèi)。

表2 2臺儀器對4種有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考物質(zhì)的測定結(jié)果

2.8 儀器空白考察

隨著全自動固相萃取儀器使用次數(shù)的增加，有可能會有玉米赤霉烯酮殘留的情況。因此每天進樣前和處理完成之后對儀器空白的監(jiān)測非常必要。圖7是連續(xù)6 d的儀器空白與標(biāo)準(zhǔn)品的對比色譜圖，可以看出儀器無殘留現(xiàn)象。

圖7 儀器空白與標(biāo)準(zhǔn)品的對比圖

3 結(jié)論

通過本方法對6個樣品從上樣到洗脫完成的前處理時間為35 min，檢出限為7 μg /kg，定量限為20 μg /kg，相關(guān)系數(shù)為 0.999 5，加標(biāo)回收率為99.0%～110.4%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～2.1%(n=6)，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.1%(n=18)，測定4種質(zhì)控物質(zhì)的結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)示值范圍內(nèi)，無顯著臺間差，無儀器殘留。本方法能夠最大限度地減少實驗人員工作量，提高工作效率，避免因人員操作導(dǎo)致的結(jié)果偏差，降低實驗人員暴露在真菌毒素和有機試劑中的風(fēng)險，可用于大量糧油樣品中玉米赤霉烯酮的精準(zhǔn)測定。