胡慶慶，魯 兗

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院 藥劑科，浙江 金華 322023)

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是指不表達(dá)雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕酮受體(progesterone receptor，PR)和表皮生長(zhǎng)因子2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)基因的一種乳腺癌亞型，其發(fā)病率約占15.5%，具有轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高和患者預(yù)后差等臨床特點(diǎn)，是目前威脅女性健康常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1-3]。由于其細(xì)胞表面缺乏激素受體，使得乳腺癌常規(guī)靶向療法對(duì)TNBC收效甚微[4]，目前臨床治療手段仍以傳統(tǒng)的化療為主。然而TNBC除了不表達(dá)ER、PR和HER2外，往往也伴隨著乳腺癌基因(breast cancer gene，BRCA)等多種基因的突變[5-6]，導(dǎo)致其成為一種高度異質(zhì)性的腫瘤類型，易對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗性，進(jìn)一步增加了治療難度。

在過(guò)去幾十年中腫瘤治療方法取得了顯著進(jìn)步，特別是基于嵌合抗原受體T細(xì)胞療法、免疫檢查點(diǎn)(PD-1、PD-L1和CTLA-4)抗體等新型免疫療法[7-8]在臨床中的成功應(yīng)用，使得腫瘤的治療進(jìn)入了一個(gè)新的里程碑，而CD8+T細(xì)胞無(wú)疑是這場(chǎng)對(duì)抗腫瘤的新戰(zhàn)役中的焦點(diǎn)。在腫瘤微環(huán)境中，激活的CD8+T細(xì)胞除了分泌穿孔素、顆粒酶外，還會(huì)分泌大量的γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ具有激活免疫系統(tǒng)、抑制血管生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯等多種抗腫瘤作用[9]。然而臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低劑量的IFN-γ抗腫瘤作用有限，而高劑量的IFN-γ易引起全身性的不良反應(yīng)[10-11]，因此IFN-γ在腫瘤的臨床治療中應(yīng)用有限。

本文將以腫瘤細(xì)胞的色氨酸代謝為突破點(diǎn)，研究低劑量的IFN-γ聯(lián)合吲哚胺2, 3-雙加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1, IDO1)抑制劑Epacadostat(Epa)對(duì)TNBC的治療作用，為將來(lái)針對(duì)TNBC的耐藥和復(fù)發(fā)而進(jìn)行的臨床治療提供新的方向和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及細(xì)胞：40只SPF級(jí)雌性6周齡NOD-SCID小鼠，體質(zhì)量(20±2)g[浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(浙)2016-0002]。小鼠三陰乳腺癌細(xì)胞系4T1和人三陰乳腺癌細(xì)胞系MBA-MD-231(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.1.2 試劑：Epacadostat(Epa)(Selleck公司)；重組人IFN-γ、重組鼠IFN-γ(R&D公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI公司)；pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)質(zhì)粒(Addgene公司)；FITC-annexin Ⅴ/PI凋亡染色試劑盒(BD公司)；抗人、鼠IDO1抗體(CST公司，1∶1 000稀釋)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：分別將5×104個(gè)4T1或MDA-MB-231細(xì)胞接種到6孔板中，每組設(shè)3復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、IFN-γ(100 ng/mL)組、Epa(20 nmol/L)組和聯(lián)用組。作用48 h后，用無(wú)EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，獲得單細(xì)胞懸液，用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取各組細(xì)胞，加入0.25%(無(wú)EDTA)的胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，4 ℃ 500×g離心5 min。棄上清，每管加入1 mL冷PBS重懸細(xì)胞，4 ℃ 500×g離心5 min，清洗細(xì)胞。棄上清，每管加入100 μL 1×偶聯(lián)緩沖液重懸細(xì)胞，然后每管分別加入2 μL annexin Ⅴ和PI，4 ℃避光孵育30 min。加入400 μL重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的情況。

1.2.3 Western blot檢測(cè)IDO1的表達(dá)：取各組細(xì)胞，加入0.25%(含EDTA)胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，4 ℃ 500×g離心5 min。棄上清，每管加入1 mL冷PBS重懸細(xì)胞，4 ℃ 500×g離心5 min，清洗細(xì)胞。加入適量RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)，超聲破碎儀超聲3個(gè)循環(huán)，充分裂解細(xì)胞。冰上裂解20 min后，4 ℃ 20 000×g離心15 min，獲得細(xì)胞總蛋白。BCA法蛋白定量后，取等量的總蛋白加入1×上樣緩沖液，100 ℃ 加熱8 min。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，加入抗IDO1一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次后加入二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h； TBST洗膜3次后，ECL曝光。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)IDO1表達(dá)：取各組細(xì)胞，1 mL Trizol裂解細(xì)胞，經(jīng)氯仿抽提、異丙醇沉淀和75%乙醇清洗總RNA后，反轉(zhuǎn)mRNA為cDNA。HomoGAPDH上游引物為5′-GCCAGCTTCGAG AAAGAGTTG-3′，下游引物為5′-ATCCCAGAACTAG ACGTGCAA-3′；MusIDO1上游引物為5′-GCTTTG CTCTACCACATCCAC-3′，下游引物為5′-CAGGC GCTGTAACCTGTGT-3′。各成分按說(shuō)明書配制好進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)時(shí)間分別為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。利用ABI自帶軟件，使用Livak 2-△△Ct法來(lái)對(duì)IDO1的表達(dá)進(jìn)行計(jì)算，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行校正。

1.2.5 CRISPR-Cas9敲除IDO1：每個(gè)基因分別設(shè)計(jì)2對(duì)sgRNA(small guide RNA)，并在其 5′-端加上CACCG得到正向寡核苷酸序列，同時(shí)在其互補(bǔ)鏈的5′-端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分別合成正反向寡核苷酸序列(表1)。

表1 IDO1 sgRNA 序列Table 1 Sequence of IDO1 sgRNA

引物合成后，通過(guò)磷酸化、變性、退火，得到具有BbsⅠ黏性末端的雙鏈 DNA 片段。經(jīng)快速連接酶的作用，將該DNA片段連接到PX458載體質(zhì)粒上。取Stbl3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍；取1 μL連接產(chǎn)物加入到50 μL Stbl3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上孵育30 min；經(jīng)42 ℃熱激90 s、冰上靜置2 min后，將目的質(zhì)粒導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)涂板、搖菌、鑒定和質(zhì)粒提取后獲得濃度較高且不含內(nèi)毒素的目的質(zhì)粒。最后使用Lipofectamine 3000將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，48 h后流式分選GFP強(qiáng)陽(yáng)性的細(xì)胞，Western blot鑒定敲除效率。

1.2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的分組及處理：分為對(duì)照組、IFN-γ組、Epa組和聯(lián)用組，每組10只小鼠。1×106的MDA-MB-231細(xì)胞接種到NOD-SCID小鼠皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至5 mm×5 mm左右時(shí)，荷瘤小鼠開(kāi)始給藥治療，并每天測(cè)量腫瘤的大小。治療組小鼠按10 mg/kg的劑量灌胃給予Epa，每2 d給藥一次；IFN-γ按20 mg/kg劑量瘤內(nèi)注射給予，2 d給藥1次。連續(xù)給藥10次后，觀察荷瘤小鼠的腫瘤大小并記錄各組小鼠的死亡時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ體外誘導(dǎo)三陰乳腺癌細(xì)胞凋亡

分別將50、100和200 ng/mL的IFN-γ作用于4T1和MDA-MB-231細(xì)胞，48 h后收獲細(xì)胞，流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明IFN-γ誘導(dǎo)三陰乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用呈劑量依賴性(圖1)。

A.proportion of apoptotic cells of 4T1 cells treated with 50, 100 or 200 ng/mL IFN-γ; B.proportion of apoptotic cells of MDA-MB-231 cells treated with 50, 100 or 200 ng/mL IFN-γ;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group

2.2 IFN-γ誘導(dǎo)三陰乳腺癌細(xì)胞上調(diào)表達(dá)IDO1

100 ng/mL 的IFN-γ處理4T1和MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，可在基因和蛋白水平顯著上調(diào)IDO1的表達(dá)(P<0.001)(圖2A，B)，并且顯著促進(jìn)培養(yǎng)上清中Kyn的產(chǎn)生(P<0.01)(圖2C)。當(dāng)敲除IDO1后，IFN-γ誘導(dǎo)4T1和MDA-MB-231的凋亡能力顯著增強(qiáng)(P<0.01)(圖2D)。

2.3 IFN-γ聯(lián)合IDO1抑制劑Epa誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

與IFN-γ或Epa單藥組相比，IFN-γ聯(lián)合Epa組可顯著增強(qiáng)三陰乳腺癌細(xì)胞的凋亡比例。(P<0.01)(圖3A, B)。此外，IFN-γ聯(lián)合Epa治療組的腫瘤生長(zhǎng)速度也明顯低于IFN-γ和Epa單藥組(P<0.01)(圖3C)，荷瘤小鼠的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.01)(圖3D)。

2.4 IFN-γ聯(lián)合IDO1抑制劑Epa顯著抑制MDA-MB-231腫瘤的生長(zhǎng)

與IFN-γ或Epa單藥組相比，IFN-γ聯(lián)合Epa組可顯著抑制荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)速度(P<0.01)(圖4A)。此外，荷瘤小鼠的生存時(shí)間也顯著延長(zhǎng)(P<0.01)(圖4B)。

3 討論

IFN-γ是主要由細(xì)胞毒性CTL和NK細(xì)胞產(chǎn)生的多效細(xì)胞因子，并且發(fā)揮重要的抗腫瘤作用。在與其受體結(jié)合后，IFN-γ開(kāi)啟JAK/STAT信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致大量干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)，一方面上調(diào)腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHC-I類分子，增強(qiáng)抗原呈遞能力，使得腫瘤細(xì)胞更容易受到細(xì)胞毒性CTL的殺傷。另一方面，IFN-γ可直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖停滯甚至死亡。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IFN-γ對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用十分微弱，200 ng/mL的IFN-γ作用48 h才能殺傷約12%。

然而，IFN-γ在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)上調(diào)其免疫抑制分子的表達(dá)，例如PD-L1和IDO1等分子，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃避。IFN-γ可通過(guò)其受體將信號(hào)傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并誘導(dǎo)酪氨酸蛋白激酶JAK磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)STAT1發(fā)生磷酸化。磷酸化的STAT1會(huì)以同源二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)IDO1的表達(dá)[12]。目前研究發(fā)現(xiàn)，IDO1在多種腫瘤細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，而且IDO1是催化色氨酸代謝為犬尿氨酸的限速酶。腫瘤細(xì)胞高表達(dá)IDO1后不僅會(huì)引起色氨酸耗竭，抑制腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞毒性CTL、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性[13]，而且，IDO1的代謝產(chǎn)物Kyn也會(huì)激活腫瘤細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的AhR信號(hào)通路，一方面經(jīng)Kyn-AhR-P27信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)[14]，躲避免疫殺傷；另一方面經(jīng)Kyn-AhR-PD-1通路誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)[15]，直接誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭。由此可見(jiàn)，IDO1的過(guò)度活化給腫瘤的免疫治療又帶來(lái)了新的難題。因此，抑制IDO1的活性在腫瘤免疫治療中有著重要的作用。

A.expression of IDO1 of 4T1 (left) and MDA-MB-231 (right) cells treated with or without 100 ng/mL IFN-γ was detected by quantitative PCR; B.expression of IDO1 of 4T1 (left) and MDA-MB-231 (right) cells treated with or without 100 ng/mL IFN-γ was detected by Western blot; C.Kyn levels in 4T1 (left) and MDA-MB-231 (right) cells lysate were determined; D.cell apoptosis ofIDO1 knock-out 4T1 (left) and MDA-MB-231 (right) cells treated with 100 ng/mL IFN-γ for 48 hours;*P<0.01,**P<0.001 compared with control group; Scr.Scramble(control); KO1/KO2.knock-out1/2

A.cell apoptosis of 4T1 cells treated with IFN-γ (100 ng/mL), Epa(20 nmol/L) or IFN-γ (100 ng/mL) combined with Epa(20 nmol/L) was determined by flow cytometry; B.cell apoptosis of MDA-MB-231 cells treated with IFN-γ, Epa or IFN-γ/Epa was determined by flow cytometry;*P<0.01 compared with IFN-γ group

A.NOD-SCID mice were inoculated with 1×106MDA-MB-231 cells, when the tumor size was 5 mm×5 mm, mice were treated with IFN-γ, Epa or IFN-γ combined with Epa for 30 days, tumor growth was measured (A) and long-term survival (B) was analyzed;*P<0.01 compared with IFN-γ group

圖4 IFN-γ聯(lián)合IDO1抑制劑Epa顯著抑制MDA-MB-231腫瘤的生長(zhǎng)

本實(shí)驗(yàn)采用三陰乳腺癌細(xì)胞系4T1和MDA-MB-231為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)IFN-γ體外對(duì)其直接的凋亡能力比較弱，但能夠顯著誘導(dǎo)4T1和MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)的IDO1分子的表達(dá)，而且細(xì)胞內(nèi)的Kyn也顯著上調(diào)。而當(dāng)利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)穩(wěn)定敲除了IDO1分子后，IFN-γ誘導(dǎo)凋亡的能力大大增強(qiáng)，表明IDO1的上調(diào)表達(dá)在三陰乳腺癌細(xì)胞抵抗IFN-γ的治療中起著重要的作用?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，采用IFN-γ聯(lián)用IDO1抑制劑Epa用于抑制三陰乳腺癌細(xì)胞系4T1和MDA-MB-231增殖。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IDO1抑制劑Epa可顯著促進(jìn)IFN-γ對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞的凋亡作用，荷瘤小鼠的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。

綜上所述，IFN-γ聯(lián)用IDO1抑制劑對(duì)三陰乳腺癌有顯著的促凋亡作用，這一發(fā)現(xiàn)為三陰乳腺癌的臨床治療提供潛在的方向和基礎(chǔ)。