王 玥，李 崢，陳 慧，張建民*，何 維*

(1.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 免疫學系，北京 100005；2.北京格根生物科技有限公司，北京 100005)

轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)是調(diào)節(jié)細胞生長、分化和免疫功能的細胞因子之一。目前人類TGF-β超家族成員中TGF-β1的功能研究最為透徹[1]。TGF-β1在許多腫瘤中高表達；臨床上，腫瘤患者血清中TGF-β1的水平與腫瘤惡性程度及預后也密切相關[2]。TGF-β1與其受體結(jié)合后，能促進腫瘤的生長及侵襲轉(zhuǎn)移；TGF-β1還可抑制細胞毒性T淋巴細胞分化、降低樹突狀細胞的抗原呈遞能力、抑制IFN-γ(γ干擾素，interferon-γ)和TNF-α(腫瘤壞死因子α，tumor necrosis factor α)的產(chǎn)生等[3]。由此可見，TGF-β1能抑制抗腫瘤免疫應答，在腫瘤免疫逃逸過程中扮演著重要角色，故通過中和抗體封閉TGF-β1是腫瘤免疫治療的關鍵點之一。

已有研究表明，靶向TGF-β1信號通路的封閉抗體，如抗TGF-β1抗體fresolimumab[4]、抗TGF-β1受體抗體lapatimab等，可以抑制腫瘤的生長和遷移；然而大部分完整抗體存在免疫原性高、易粘黏聚集和易被蛋白酶降解等缺點。納米抗體(nanobodies or nanoantibodies)是羊駝外周血中天然缺失輕鏈的特殊抗體，該抗體僅由重鏈可變區(qū)(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)和恒定區(qū)(cons-tant region, CH2、CH3)組成，單獨的VHH區(qū)具有同樣特異的抗原結(jié)合能力[5-6]。因此，靶向TGF-β1的新型納米抗體能彌補傳統(tǒng)TGF-β1抗體的固有缺陷，在抗腫瘤免疫治療中具有廣闊的應用前景。

基于此，本研究旨在制備并鑒定羊駝來源的高特異性、高親和力的抗TGF-β1納米抗體，為其臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、M13K07輔助噬菌體(北京全式金生物技術公司)；cFUGW真核表達載體、pGEX6P.1原核表達載體、人胚胎腎上皮細胞系HEK-293T、人肺癌細胞系NCI-H520(本實驗室保存)；GSTrapTMFF 1 mL色譜柱(GE公司)；抗His單克隆抗體、抗GST單克隆抗體(CST公司)；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠和HRP標記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 真核表達質(zhì)粒cFUGW-TGF-β1的構建與蛋白表達純化：通過PCR引物，分別在TGF-β1兩端引入AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位點，并設計6×His用于重組蛋白的純化；挑取文庫內(nèi)TGF-β1菌為模板進行PCR。利用AgeⅠ和EcoRⅠ分別對cFUGW空載體及PCR純化產(chǎn)物進行酶切、連接并轉(zhuǎn)化，得到cFUGW-TGF-β1重組質(zhì)粒。瞬時轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，收集48～72 h的細胞培養(yǎng)上清，純化帶有His標簽的目的蛋白；用Western blot檢測蛋白表達及其純度。

1.2.2 羊駝噬菌體VHHs展示文庫的構建：初次免疫將1 mg TGF-β1純化蛋白1：1充分乳化于完全弗氏佐劑，采用皮下注射的方式免疫羊駝；之后使用不完全弗氏佐劑，蛋白劑量為0.5 mg/次；共免疫5次，單次間隔為20 d。在最后一次加強免疫3～4 d后，于被免疫羊駝頸靜脈處采集100 mL抗凝血。提取外周血單個核細胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別利用CALL001引物、CALL002引物和VHH-BACK引物、聚合酶鏈反應引物(polymerase chain reaction primers，PMCF)引物(表1)進行2輪巢式PCR，純化400 bp的擴增條帶，即得到重鏈可變區(qū)(VHH)片段。

表1 噬菌體文庫構建所用引物Table 1 Primers for phage library construction

將純化的巢式PCR產(chǎn)物與pMCES載體連接后，電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中；經(jīng)單克隆挑取、菌落PCR后，推算羊駝TGF-β1-VHH噬菌體抗體庫容量(克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)×104)。

1.2.3 TGF-β1-VHH納米抗體的特異性篩選：取VHH庫，加入M13K07輔助噬菌體培養(yǎng)，在ELISA板中預包被TGF-β1純化蛋白，分別使用噬菌體顆粒作為一抗，羊抗駝IgG-HRP作為二抗，顯色后讀取405 nm處吸光度值。

1.2.4 TGF-β1-VHH納米抗體的原核誘導表達與純化：將陽性重組噬菌體與pGEX6P.1-GST原核表達載體連接，構建pGEX6P.1-VHH原核表達質(zhì)粒。對陽性菌株進行原核誘導表達，分別收集上清及包涵體檢測表達情況；細菌裂解液上清經(jīng)GSTrapTMFF 1 mL色譜柱純化，Western blot檢測其表達。

1.2.5 TGF-β1-VHH納米抗體的結(jié)合特異性檢測：利用TGF-β1-VHH納米抗體B3、C8或市售兔源TGF-β1單抗為一抗，分別用Western blot和免疫熒光，檢測其與NCI-H520細胞全蛋白裂解液中的和NCI-H520細胞爬片上的TGF-β1蛋白的結(jié)合。

1.2.6 ForteBio Octer?檢測分子相互作用實驗:將TGF-β1純化蛋白梯度稀釋，利用TGF-β1-VHH納米抗體B3和C8的GST標簽與預裝GST傳感器偶聯(lián)，利用生物傳感器原理，檢測不同濃度的TGF-β1純蛋白與納米抗體的結(jié)合情況，計算親和力。

2 結(jié)果

2.1 真核表達質(zhì)粒cFUGW-TGF-β1的構建與鑒定

經(jīng)PCR擴增的人TGF-β1標準全長DNA序列，長度為1 188 bp(圖1A)；雙酶切鑒定顯示3 518 bp和6 895 bp的兩條條帶(圖1B)，提示cFUGW-TGF-β1重組質(zhì)粒構建成功。

A.arrow was the PCR product of target gene；M.1 ku DNA ladder B.lane1～3 showed plasmid cFUGW-TGF-β1 digested by Pac Ⅰ and Ahd Ⅰ；lane 4 was used as a negative control；M.1 ku DNA ladder圖1 真核表達質(zhì)粒cFUGW-TGF-β1的構建與鑒定Fig 1 Construction and identification of eukaryotic expression plasmid cFUGW-TGF-β1

2.2 重組TGF-β1蛋白的表達純化及鑒定

cFUGW-TGF-β1重組質(zhì)粒無熒光出現(xiàn)(圖2B)，同期空載質(zhì)?？梢哉z測到綠色熒光(圖2A)。轉(zhuǎn)染293T細胞培養(yǎng)上清中可以成功檢測到潛在型相關肽(latency-associated peptide，LAP)前體、TGF-β1單體及少量二聚體，而細胞裂解液中僅檢測到LAP前體；未轉(zhuǎn)染293T細胞上清也可檢測到少量LAP前體的表達(圖2C)。

HisTrap填料對轉(zhuǎn)染293T細胞培養(yǎng)上清進行親和層析的結(jié)果顯示，Lane 3/4孔內(nèi)三種形式的TGF-β1均得到較好的純化(圖3)。

2.3 羊駝噬菌體文庫的構建與TGF-β1-VHH納米抗體的親和篩選

2次PCR分別獲得700 bp的通用抗體重鏈VH(圖4A)和400 bp的TGF-β1-VHH片段(圖4B)。菌落PCR結(jié)果顯示，TGF-β1-VHH片段的陽性克隆率在70%左右(圖4C)；根據(jù)公式估算羊駝TGF-β1-VHH噬菌體庫菌板(圖4D)的有效庫容可達1.2×108。

ELLSA檢測隨機挑選的21株克隆與重組TGF-β1蛋白的結(jié)合情況，篩選得到B3、C5、C8、F4、F6、G6和G8，7株陽性克隆(圖5)。

A.cFUGW/BF; B.cFUGW-TGF-β1/BF; C.Western blot of recombinant TGF-β1 protein expression; 1/2 was supernatant/cell lysate of untransfected group；3/4～5/6 were of transfection group；M.protein marker

圖2 重組TGF-β1蛋白在HEK-293T細胞中的瞬時表達
Fig 2 Identification of transient expression of recombinant TGF-β1 protein in HEK-293T cells

A.coomassie brilliant blue; B.Western blot experiments identified purification：1.supernatant before purification；2.flow-through solution；3-7.different purification elution wells；M.protein marker

圖3 重組TGF-β1的純化與鑒定
Fig 3 Purification and identification of recombinant TGF-β1 proteins

A:1-7.PCR1 amplified VH gene fragments, M.1 ku DNA ladder; B：1-6.PCR2 amplified VHH gene fragments, M.1 ku DNA ladder; C:colony PCR identification of phage library; D: phage library plates at 1∶10 000 000 and 1∶100 000 dilutions

圖4 TGF-β1-VHH噬菌體展示庫構建
Fig 4 Construction of TGF-β1-VHH phage display library

2.4 TGF-β1-VHH納米抗體的原核誘導表達與純化

電泳及Western blot結(jié)果顯示，TGF-β1-VHH納米抗體與GST融合蛋白(分子質(zhì)量為36 ku)在上清和包涵體中均得到了表達(圖6A,B)。高表達克隆株B3和C8純化后上清中納米抗體可得到有效富集(圖6C,D)。

2.5 TGF-β1-VHH納米抗體的結(jié)合特異性檢測

純化后B3、C8納米抗體及市售TGF-β1抗體對TGF-β1均有較好的結(jié)合，其中市售抗體的非特異性背景更低，納米抗體B3略優(yōu)于C8(圖7A)。免疫熒光結(jié)果顯示，市售抗體對NCI-H520細胞表面TGF-β1的識別更為特異，B3略強于C8(圖7B)，與Western blot結(jié)果相吻合。

融合表達的納米抗體B3和C8與TGF-β1蛋白的親和力檢測顯示，二者屬于慢結(jié)合和慢解離模式，親和力常數(shù)KD(M)分別為1.48×10-9mol/L、9×10-9mol/L，均屬于較強結(jié)合(圖8)。

B3～G8 monoclones were randomly selected; the arrows showed 7 positive clones; the negative control BL was PBS圖5 TGF-β1-VHH納米抗體的結(jié)合特性Fig 5 Binding activities of TGF-β1-VHH nanobodies

A，B.lane1/2-13/14 refered to supernatant/inclusion bodies of C5，F(xiàn)6，C8，F(xiàn)4，B3，G6 and G8; C，D.lane1/2-3/4 refered to supernatant/inclusion bodies of B3 and C8 before purification；lane5/6～7/8 refered to supernatant/inclusion bodies of B3 and C8 after purification

圖6 TGF-β1-VHH納米抗體的原核表達與純化
Fig 6 Prokaryotic expression and purification of TGF-β1-VHH nanobodies

A.Western blot detection of nanobodies; Samples of lane1-12 were 10 μg tumor cell lysate；M.protein marker; B.immunofluorescence detection of nanobodies

圖7 TGF-β1-VHH納米抗體與NCI-H520細胞的TGF-β1結(jié)合特異性檢測
Fig 7 Binding assay of TGF-β1-VHH nanobodies with NCI-H520 cells

different colors are gradient diluted TGF-β1 protein圖8 TGF-β1-VHH納米抗體與TGF-β1的親和力檢測Fig 8 Affinities of TGF-β1-VHH nanobodies with recombinant TGF-β1 proteins

3 討論

TGF-β1是一類典型的免疫抑制性細胞因子，腫瘤微環(huán)境中的TGF-β1在腫瘤免疫逃逸中至關重要，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。

人的TGF-β1首先形成LAP前體，被水解后，可釋放出成熟TGF-β1單體或二聚體。在本研究中用于免疫羊駝的純化蛋白包含LAP前體、TGF-β1單體及二聚體，故所得納米抗體可同時識別三種形式的TGF-β1。

納米抗體是目前已知天然來源的最小抗原結(jié)合單位，同時它還是理想的靶向示蹤分子，通過偶聯(lián)不同物質(zhì)進行放射免疫成像等可精確診斷多種疾病[7-9]。它兼具小分子藥物與傳統(tǒng)抗體的優(yōu)勢：穩(wěn)定性高、特異性強、可穿透血腦屏障、人源化、簡單且適用于多種表達系統(tǒng)[10]。本研究制備的B3和C8等納米抗體，可有效中和腫瘤微環(huán)境中自分泌或旁分泌TGF-β1，有望在抵消腫瘤免疫逃逸、抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。