吳友明，劉娜斯，曹明月，黃 薇，劉雁勇，楊 楠

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理學(xué)系，北京 100005)

根據(jù)《2018年全球癌癥統(tǒng)計報告：全球185個國家36種癌癥發(fā)病率和死亡率的估計》，肺癌的全球發(fā)病率及死亡人數(shù)均高居榜首[1]。肺癌發(fā)病患者中約80%是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，5年生存率從IA期患者的67%降至IIIA期患者的23%[2]。因此，對非小細胞肺癌的治療是一個亟待解決的難題。多西他賽(docetaxel，DTX)是紫杉醇的半合成類似物，被廣泛用于治療NSCLC，然而化學(xué)抗藥性是限制其應(yīng)用的主要障礙[3-4]。

熱休克蛋白90(heat shock protein 90, Hsp90)在幫助致癌蛋白(包括Akt，EGFR，Met，Her-2等)的成熟和穩(wěn)定中起著重要作用[5]，而這些蛋白在腫瘤細胞的凋亡，增殖中發(fā)揮著重要作用。Hsp90抑制劑與抗腫瘤藥物聯(lián)用時，能夠顯著提高治療效果[6-7]。在前期研究中，本研究室通過噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)了具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的七肽P7(序列 LPLTPLP)，其作為一種小分子多肽能夠特異性識別細胞表面Hsp90(KD=6.53×10-5mol/L)，并誘導(dǎo)其降解，為一種兼具靶向和抑制的雙功能多肽[8]。本研究探討了P7與DTX聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細胞凋亡的相關(guān)機制，為增強DTX療效、降低毒性提供了新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

人肺腺癌細胞系(human lung adenocarcinoma cell line)A549(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心)；CCK-8細胞增殖-毒性試劑盒、凋亡檢測試劑盒(上海東仁化學(xué)科技有限公司)；多西他賽(DTX)(北京中碩醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)；多肽P7(上海吉爾生化公司合成)；所有單克隆抗體(Cell Signal Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人肺腺癌細胞系A(chǔ)549在含有10%胎牛血清和適量抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活性：將A549細胞接種至96孔板中(3×103個細胞/孔)，過夜后加藥處理，分別是：1)DTX組：0～10 μmol/L共設(shè)8個濃度梯度；2)P7組：0～10 mmol/L共設(shè)8個濃度梯度；3)0～10 μmol/L DTX(7個濃度梯度)聯(lián)用1、10和50 μmol/L P7。培養(yǎng)48 h后，加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1～2 h，采用TECAN Infinite F50 酶標儀在波長450 nm處檢測吸光度值。采用GraphPad軟件繪制細胞生存曲線并計算IC50。

1.2.3 蛋白免疫印跡法檢測：使用蛋白免疫印跡法檢測DTX和P7單用或聯(lián)用對相關(guān)蛋白表達水平的影響。取對數(shù)增殖期的A549細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，每皿1×106個細胞，培養(yǎng)過夜后進行加藥處理。分組如下：空白對照組；P7(10 μmol/L)單藥組；DTX(1 nmol/L)單藥組；P7(10 μmol/L)與DTX(1 nmol/L)聯(lián)合用藥組。然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取細胞蛋白及蛋白免疫印跡法見參考文獻[9]。

1.2.4 流式細胞儀凋亡檢測：采用流式細胞計量術(shù)檢測多肽DTX與P7單用或聯(lián)合處理后A549細胞的凋亡率。按照上述實驗方法培養(yǎng)并分組處理細胞，流式細胞計量術(shù)步驟見參考文獻[10]。樣品準備完成后，使用BD AccuriTMC6流式細胞儀上機檢測分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 多肽P7與化療藥物DTX聯(lián)合對A549細胞存活的影響

結(jié)果表明，DTX能夠抑制A549細胞的存活，半數(shù)抑制濃度(IC50)為(0.45±0.22)nmol/L(圖1A)。為了探討DTX與Hsp90雙功能靶向抑制多肽P7聯(lián)用的可能性，首先檢測了P7對A549細胞的毒性，其IC50為(75.6 ± 13.7)μmol/L(圖1B)。據(jù)此，本研究將不同濃度梯度的DTX分別聯(lián)合1、10和50 μmol/L P7共處理，結(jié)果表明聯(lián)合用藥后DTX的IC50明顯降低(圖1C)。

此外，本研究還計算了聯(lián)合作用指數(shù)(combined index, CI)，判斷DTX與P7的協(xié)同性，方法見參考文獻[11]。計算公式：CI=DA/ICXA +DB/ICXB(A、B代表兩種不同藥物，ICXA和ICXB是兩種藥物單獨使用使生長抑制率達X時的藥物濃度，DA和DB是兩藥聯(lián)用使生長抑制率達X時兩種藥物的濃度)。當(dāng)CI>1、CI=1或CI<1時，兩藥分別為拮抗、疊加或協(xié)同作用。分析抑制率Fa-合用指數(shù)CI曲線顯示，當(dāng)DTX+1 μmol/L P7 effect(Fa)大于0.13時、DTX+10 μmol/L P7 effect(Fa)大于0.53時，CI都小于1，這進一步表明DTX和P7有協(xié)同作用(圖 1D)。

2.2 DTX與P7聯(lián)合用藥促進細胞凋亡

A549細胞經(jīng)DTX 1 nmol/L或P7 10 μmol/L單獨處理48 h后，細胞凋亡率分別為6.86%±1.36%和13.7%±2.54%；當(dāng)DTX 1 nmol/L與P7 10 μmol/L共處理48 h后，DTX與P7聯(lián)用組細胞凋亡率為22.9%±3.12%，與對照組相比顯著升高(P<0.01)，是其6.5倍；與DTX單藥組相比，DTX與P7聯(lián)用組細胞凋亡比例也顯著升高(P<0.05)，約為DTX組的1.7倍(圖2A,B)。凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示，與對照組相比，DTX與P7聯(lián)合處理顯著降低了抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表達水平(P<0.05)(圖2C,D)。同時，與對照組相比，DNA修復(fù)酶PARP表達量顯著降低(P<0.05)以及水解產(chǎn)物cleaved-PARP表達量顯著升高(P<0.05)(圖2C,E,F)。與DTX組相比，DTX與P7聯(lián)用組cleaved-PARP的表達量顯著上升4倍(P<0.05)(圖2C,F)。

2.4 DTX與P7聯(lián)合用藥對耐藥相關(guān)蛋白的影響

不同藥物處理后，給藥組與對照組相比，DTX與P7聯(lián)用組以及P7單藥組的主要穹窿蛋白MVP(major vault protein，MVP)表達量顯著降低(P<0.05)；與DTX組相比，DTX與P7聯(lián)用組的MVP表達量顯著降低(P<0.05)(圖3A,B)。

A.cytotoxicity of DTX was assessed in A549 cells following 48 hours treatment; B.cell cytotoxicity of P7 was assessed in A549 cells following 48 hours treatment; C.effects of DTX combined with P7 on survival of A549 cells; D.Fa-CI plot

A.following 48 hours treatment with vehicle control，P7 10 μmol/L or DTX 1 nmol/L or P7 10 μmol/L combined with DTX 1nmol/L, A549 cells were subjected to annexin V/PI staining and flow cytometry analysis to quantify cell apoptosis rate; B.bar charts showed quantification of cell death data from 3 independent experiments, including early apoptotic cells (right bottom quadrant) and late apoptotic cells (right upper quadrant); C.effect of DTX or/and P7 on apoptosis-related proteins in A549 cells by Western blot；D.Bcl-2 expression levels following the treatment of DTX or/and P7；E.PARP expression levels following the treatment of DTX or/and P7；F.cleaved-PARP expression levels following the treatment of DTX or/and P7；*P<0.05,**P<0.01 compared with vehicle control;#P<0.05 compared with DTX group

A.effect of DTX or/and P7 on multidrug-resistant proteins in A549 cells by Western blot; B.MVP expression levels following the treatment of DTX or/and P7;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with DTX group

3 討論

Hsp90參與了眾多信號調(diào)控，其主要作用是維持細胞內(nèi)眾多蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。因此，抑制腫瘤細胞內(nèi)的Hsp90往往導(dǎo)致胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路不穩(wěn)定，最終抑制腫瘤細胞的生存與轉(zhuǎn)移[12]。研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞中Hsp90的表達水平比正常細胞高2～10倍[13]。因此，Hsp90成為了熱門抗腫瘤藥物研發(fā)靶點，目前的抑制劑包括：ganetespib、AUY922和17-DMAG等。但由于肝毒性較大等原因，臨床實驗均未達到理想的效果[14]，限制了其進一步的發(fā)展。

由于靶向肽獨有的高親和力、高組織滲透率，能避免產(chǎn)生上述不良反應(yīng)。且其高親和力靶向性能夠使得其在與化療藥聯(lián)合使用時降低單獨用藥的給藥劑量，從而減小藥物的不良反應(yīng)。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)了具有Hsp90靶向與抑制雙重功能的多肽P7[8]。為利用DTX與P7聯(lián)合用藥，探究其對NSCLC細胞A549的影響創(chuàng)造了條件。

本研究在確定了DTX與P7具有協(xié)同作用后，進一步探討了抗凋亡蛋白Bcl-2，以及細胞凋亡的關(guān)鍵指標——PARP的剪切。Bcl-2可以抑制由多種細胞毒因素所引起的細胞凋亡，但其本身不能促進DNA修復(fù)。而PARP作為一種DNA修復(fù)酶，在細胞凋亡發(fā)生時將被剪切失去酶活力形成cleaved-PARP。cleaved-PARP的上調(diào)表明藥物對細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，DTX和P7聯(lián)合用藥能顯著降低抗凋亡因子Bcl-2，同時cleaved-PARP顯著升高，說明DTX和P7協(xié)同增效促進了細胞凋亡。為了進一步探討其促進凋亡的原因，本研究檢測了DTX和P7聯(lián)合用藥對主要穹窿蛋白(MVP)表達水平的影響。MVP的過表達是細胞耐藥的原因之一，其可能介導(dǎo)了藥物的轉(zhuǎn)運過程[15]。腫瘤細胞可能通過過表達MVP來降低細胞內(nèi)DTX濃度，從而抑制細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，DTX和P7聯(lián)合用藥，能夠顯著降低MVP表達量。這提示DTX與P7聯(lián)合給藥可能是通過降低MVP促進其凋亡的。

綜上所述，P7能協(xié)同DTX抑制A549細胞的存活并誘導(dǎo)其凋亡。其機制可能與降低凋亡抑制蛋白Bcl-2表達水平、失活DNA修復(fù)酶PARP及降低耐藥蛋白MVP表達有關(guān)。本研究為未來提高NSCLC細胞對DTX的藥物敏感性及降低其不良反應(yīng)提供了新的研究思路。