曹鄧晗，陳奎生

(1.鄭州市第一人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河南 鄭州 450004； 2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科，河南 鄭州 450052)

microRNAs(miRNAs)是人類基因組中一類調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移的重要小RNA分子，通過(guò)與其靶基因的3′UTR區(qū)特異性結(jié)合抑制或激活靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)而發(fā)揮作用[1]。miR-197在不同癌中發(fā)揮著重要的致癌基因或抗癌基因作用，是一種潛在的新型癌生物標(biāo)志物[2]。甲狀腺癌患者血清中miR-197的升高與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。但miR-197對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機(jī)制還不清楚。

惡性腦瘤缺失1基因(deleted in malignant brain tumors 1，DMBT1)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其在甲狀腺癌、鼻咽癌和膽道癌等腫瘤組織中表達(dá)缺失，與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)[4-6]。本文探討，miR-197-3p和DMBT1對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：正常甲狀腺細(xì)胞系Nthy-ori 3-1和甲狀腺癌細(xì)胞系SW579及CGTHW-1(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

1.1.2 主要試劑：胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；LipofectamineTM2000試劑和MTT溶液(Solarbio公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物科技研究所)；康寧Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；miR-197-3p抑制物(miR-197-3p inhibitor)及其無(wú)意義對(duì)照(inhibitor nosense control)、miR-197-3p模擬物(miR-197-3p mimics)及其無(wú)意義對(duì)照(mimics nosense controlpc)和小干擾RNA(siRNA)無(wú)意義序列及siRNA-DMBT1(廣州銳博生物科技有限公司)；pcDNA3.1空載體及pcDNA3.1-DMBT1(湖南豐暉生物科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)用蛋白抗體及相應(yīng)二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)：將Nthy-ori 3-1、SW579及CGTHW-1細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞接近90%匯合時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞5 min左右，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-197-3p表達(dá)水平：收集對(duì)數(shù)期的Nthy-ori 3-1、SW579和CGTHW-1細(xì)胞，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品A260/A280比值為1.8～2.0，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣品出現(xiàn)3條完整條帶，表示RNA樣品純度和完整性符合實(shí)驗(yàn)要求。以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以U6為內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR反應(yīng)。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-197-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞的分組及轉(zhuǎn)染：收集對(duì)數(shù)期的SW579細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右，使用LipofectamineTM2000試劑將miR-197-3p inhibitor及inhibitor nosense control、pcDNA3.1及pcDNA3.1-DMBT1分別轉(zhuǎn)染SW579細(xì)胞，并分別記為anti-miR-NC組、anti-miR-197-3p組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-DMBT1組，另將miR-197-3p inhibitor分別與siRNA-DMBT1、siRNA nosense control轉(zhuǎn)染SW579細(xì)胞并記為anti-miR-197-3p+si-DMBT1組、anti-miR-197-3p+si-NC組，轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取轉(zhuǎn)染的各組SW579細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔接種于96孔板中，每組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48和72 h時(shí)，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出孔內(nèi)上清液并加入150 μL二甲基亞砜溶液振蕩孵育15 min左右。酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度值(A值)。

1.2.5 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲：取瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的各組SW579細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL。在transwell小室的下室中加入600 μL DMEM完全培養(yǎng)基，另取150 μL細(xì)胞懸液加入上室，培養(yǎng)24 h后，取出小室并吸去上室液體，室溫下加入甲醇固定30 min，然后在Giemsa染色液中染色15～30 min，清水沖洗小室并用棉簽輕輕擦去上室表面細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野區(qū)(×200)計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)目；另取Transwell小室，在下室中加入100 μL Matrigel基質(zhì)膠和無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基混合液(1∶5)，上室中加入50 μL Matrigel基質(zhì)膠并接種50 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后取出小室，4 ℃下加入5%戊二醛固定，然后加入0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野區(qū)(×200)計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)目。

1.2.6 Western blot檢測(cè)DMBT1、cyclinD1、p21、MMP-2和E-cadherin蛋白表達(dá)：收集轉(zhuǎn)染的各組SW579細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，取適量蛋白樣品與1×SDS上樣緩沖液按體積比1∶5混合均勻，放入沸水中5 min使蛋白變性。室溫下冷卻后，進(jìn)行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜，封閉液中封膜1 h。洗膜，加入稀釋的DMBT1、cyclinD1、p21、MMP-2、E-cadherin和GAPDH抗體一抗4 ℃過(guò)夜孵育，洗膜后加入辣根光氧化酶標(biāo)記的二抗室溫輕搖2 h。加入ECL化學(xué)發(fā)光液中顯影，放入Gel-Pro凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照，以GAPDH蛋白條帶為對(duì)照分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-197-3p和DMBT1的靶向關(guān)系:構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因DMBT1的3′UTR區(qū)及突變后的3′UTR區(qū)載體，分別與miR-197-3p mimics、mimics nosense control共轉(zhuǎn)染SW579細(xì)胞，48 h后收獲細(xì)胞并檢測(cè)細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-197-3p在Nthy-ori 3-1、SW579和CGTHW-1細(xì)胞中的表達(dá)

與正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1比較，甲狀腺癌細(xì)胞SW579及CGTHW-1中miR-197-3p相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with Nthy-ori 3-1 group圖1 miR-197-3p在Nthy-ori 3-1、SW579、 CGTHW-1細(xì)胞中的表達(dá)Fig 1 Expression of miR-197-3p in Nthy-ori 3-1, SW579 and CGTHW-1

2.2 抑制miR-197-3p對(duì)SW579細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與anti-miR-NC組比較，anti-miR-197-3p組SW579細(xì)胞中miR-197-3p相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)(圖2A)，培養(yǎng)48和72 h時(shí)細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)(圖2B)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.05)(圖2C)，細(xì)胞中cyclin D1蛋白和MMP-2蛋白表達(dá)降低而p21蛋白和E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(圖2D)。

2.3 miR-197-3p靶向調(diào)控DMBT1

miR-197-3p能夠與DMBT1的3′UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合(圖3A)；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明(圖3B)，過(guò)表達(dá)miR-197-3p明顯抑制SW579細(xì)胞中DMBT1的轉(zhuǎn)錄活性，將DMBT1的3′UTR區(qū)突變后miR-197-3p的抑制作用消失；與miR-NC組比較，miR-197-3p組SW579細(xì)胞中DMBT1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-197-3p組SW579細(xì)胞中DMBT1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(圖3C)。

2.4 過(guò)表達(dá)DMBT1對(duì)SW579細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-DMBT1組SW579細(xì)胞中DMBT1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(圖4C)，培養(yǎng)48和72 h時(shí)細(xì)胞增殖活性降低(P<0.05)(圖4A)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目減少(P<0.05)(圖4B)，細(xì)胞中cyclinD1蛋白和MMP-2蛋白表達(dá)降低而p21蛋白和E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(圖4C)。

A.relative expression of miR-197-3p was detected by RT-qPCR; B.proliferation activity was detected by MTT assay; C.cell migration and invasion were detected by Transwell chamber assay; D.relative expression of cyclin D1, p21, E-cadherin and MMP-2 protein was detected by Western blot;*P<0.05 compared with anti-miR-NC group

A.miR-197-3p bound to the 3′UTR targeting ofDMBT1; B.double luciferase reporting experiment; C.relative expression ofDMBT1 protein was detected by Western blot;*P<0.05 compared with miR-NC group;#P<0.05 compared with anti-miR-NC group

2.5 抑制DMBT1能逆轉(zhuǎn)miR-197-3p對(duì)SW579細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與anti-miR-197-3p+si-NC組比較，anti-miR-197-3p+si-DMBT1組細(xì)胞中DMBT1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(圖5C)，培養(yǎng)48和72 h時(shí)細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)(P<0.05)(圖5A)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目增多(P<0.05)(圖5B)，細(xì)胞中cyclinD1蛋白和MMP-2蛋白表達(dá)升高而p21蛋白和E-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(圖5C)。

3 討論

miRNA作為抑瘤或促瘤因子及細(xì)胞中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子參與腫瘤惡性進(jìn)展的研究越來(lái)越多，為腫瘤靶向治療提供了新途徑[7-8]。miR-197-3p作為一種重要的miRNA，在膀胱癌、肺癌及骨肉瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-197-3p在甲狀腺癌細(xì)胞SW579和CGTHW-1中均呈高表達(dá)；抑制miR-197-3p后甲狀腺癌細(xì)胞SW579中cyclinD1蛋白和MMP-2蛋白表達(dá)降低；p21蛋白和E-cadherin蛋白表達(dá)升高；細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力降低。說(shuō)明miR-197-3p異常表達(dá)與甲狀腺癌增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)。

DMBT1定位于人染色體10q26.13，其編碼一種多功能的大分子糖蛋白，可通過(guò)介導(dǎo)蛋白質(zhì)間相互作用發(fā)揮促進(jìn)上皮分化及保護(hù)黏膜等多種生理作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-197-3p可與DMBT1的3′UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，并證實(shí)在甲狀腺癌SW579細(xì)胞中miR-197-3p靶向負(fù)調(diào)控DMBT1的表達(dá)。過(guò)表達(dá)DMBT1的鼻咽癌細(xì)胞增殖能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性增強(qiáng)[13]。提示DMBT1具有抑癌作用。本研究利用表達(dá)DMBT1轉(zhuǎn)染的SW579細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲明顯降低，說(shuō)明DMBT1在甲狀腺癌中也發(fā)揮抑癌作用。為證實(shí)miR-197-3p對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響是否與靶向DMBT1有關(guān)，本研究構(gòu)建同時(shí)抑制DMBT1和miR-197-3p表達(dá)，SW579細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)同時(shí)抑制DMBT1和miR-197-3p表達(dá)的SW579細(xì)胞增殖、 遷移和侵襲均明顯增強(qiáng)，說(shuō)明抑制DMBT1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-197-3p對(duì)SW579細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。證實(shí)miR-197-3p對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響與靶向DMBT1有關(guān)。

A.cell proliferation activity was detected by MTT assay; B.cell migration and invasion were detected by Transwell chamber assay; C.relative expression of DMBT1, cyclin D1, p21, E-cadherin and MMP-2 protein was detected by Western blot;*P<0.05 compared with pcDNA3.1 group

A.cell proliferation activity was detected by MMT assay; B.cell migration and invasion were detected by Transwell chamber assay; C.relative expression of DMBT1, cyclin D1, p21, E-cadherin and MMP-2 protein was detected by Western blot;*P<0.05 compared with anti-miR-NC group;#P<0.05 compared with anti-miR-197-3p+si-NC group

圖5 抑制DMBT1能逆轉(zhuǎn)miR-197-3p對(duì)SW579細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

綜上所述，miR-197-3p在甲狀腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，干擾miR-197-3p可通過(guò)靶向調(diào)控DMBT1的表達(dá)抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究為miR-197-3p在甲狀腺癌靶向治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。