何 銳，朱燁柯，滕文彬，單 躍，易聲華，祝勝美，李玉紅,3*

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 杭州 310006；2.紹興市人民醫(yī)院 麻醉科, 浙江 紹興 312000；3.紹興市人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)研究中心，浙江 紹興 312000)

膿毒癥(sepsis)是一種威脅生命的多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，由于宿主對(duì)感染的反應(yīng)功能失調(diào)[1]，在重癥患者中發(fā)病率高，醫(yī)療資源耗費(fèi)大。盡管醫(yī)療技術(shù)日益進(jìn)步，但病死率仍高達(dá)30%～70%[2]。腸道是體內(nèi)最大的細(xì)菌儲(chǔ)存庫(kù)，是膿毒癥的“啟動(dòng)器”，也是“靶器官”[3]。腸黏膜上皮細(xì)胞形成屏障阻止腸內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素入血，是人體最大的免疫器官。腸黏膜屏障作用機(jī)制復(fù)雜，可能與腸機(jī)械屏障、局部生物因素、化學(xué)因素和免疫功能有關(guān)。水通道蛋白 3(aquaporin-3, AQP3)是一種特殊的固有膜蛋白，分子質(zhì)量為30 ku，具有疏水性，屬于水通道蛋白家族成員之一。

AQP3在消化系統(tǒng)多個(gè)部位表達(dá)[4]，調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖、遷移以及運(yùn)輸甘油和過(guò)氧化氫等。AQP3在小腸中表達(dá)豐富，但其是否對(duì)腸黏膜屏障具有保護(hù)作用，尤其是膿毒癥受損腸黏膜的保護(hù)作用尚不清楚。在既往研究的基礎(chǔ)上，提出如下假設(shè)：AQP3對(duì)膿毒癥腸黏膜損傷具有保護(hù)作用。為驗(yàn)證此假設(shè)，本研究以甘油替代AQP3試驗(yàn)，通過(guò)觀察膿毒癥小鼠小腸黏膜病理學(xué)改變，血漿二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)和腸型脂肪酸結(jié)合蛋白2(intestinal type fatty acid binding protein 2, I-FABP/FABP2)濃度變化，以探索AQP3對(duì)膿毒癥小鼠腸黏膜功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠48只，6～8周，體質(zhì)量20～25 g(浙江省動(dòng)物研究中心 [許可證號(hào)：SCXK(浙)2-14-0001]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在20 d內(nèi)完成。研究方案經(jīng)紹興市人民醫(yī)院學(xué)術(shù)委員會(huì)和浙江大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)以及動(dòng)物管理委員會(huì)討論通過(guò)(倫理審批文號(hào)：ZJU2015-207-10)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行。

1.1.2 試劑與試劑盒：七氟烷(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；檸檬酸舒芬太尼注射液(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)；鹽酸羅哌卡因(阿斯利康制藥有限公司)；甘油(glycerol)(湖南二康藥業(yè)有限公司)；DAO和FABP2試劑盒(Cloud-Clone Corp公司)；HE染色試劑盒和Western blot試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；AQP3和β-actin抗體(一抗，Abcam公司)；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗，Jackson公司)；免疫組化試劑盒(杭州昊鑫生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理：將小鼠用隨機(jī)數(shù)字法分為4組，分別為假手術(shù)組 (n=6只)、假手術(shù)+口服甘油組(n=6只)、膿毒癥時(shí)間依賴組(n=24只)為建模后分別于0、6、12和24 h 4個(gè)時(shí)點(diǎn)處死動(dòng)物，每個(gè)時(shí)點(diǎn)6只)和膿毒癥+口服甘油組(n=6)。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture, CLP)[5]，復(fù)制腹腔感染型膿毒癥小鼠模型?？诜视徒M動(dòng)物術(shù)后6 h口服甘油(飲用水2%)[6]，其余組自由飲水。

1.2.2 標(biāo)本采集與處置：膿毒癥時(shí)間依賴組，于CLP后0、6、12和24 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，其他3組術(shù)后24 h處死動(dòng)物，取眼球血1 mL，置入EDTA抗凝管中，置于2～10 ℃冰箱中，1 h后4 ℃，3 000 r/min離心10 min，分裝血漿，-80 ℃保存，用于DAO和FABP2檢測(cè)。采集小鼠小腸組織，一部分于10%中性甲醛固定后，經(jīng)脫水，石蠟包埋制成蠟塊用于形態(tài)學(xué)或者免疫組化研究；另一部分分裝于凍存管中，存于-80 ℃，用于檢測(cè)AQP3表達(dá)。

1.2.3 病理學(xué)檢測(cè)腸黏膜形態(tài)學(xué)改變：石蠟包埋塊經(jīng)切片、HE染色、封固，常規(guī)光鏡下觀察小腸組織形態(tài)學(xué)改變，按照Chiu’s評(píng)分法判定判定小腸組織損傷程度[7]。

1.2.4 免疫組化測(cè)定腸黏膜AQP3表達(dá)：取小鼠小腸組織標(biāo)本行免疫組織化學(xué)染色，采用檸檬酸鹽緩沖液(0.01 moL/L)高溫高壓抗原修復(fù)，常規(guī)透膜，5% BSA室溫封閉1 h，滴加抗-AQP3抗體(1∶1 200)4 ℃過(guò)夜。HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000) 37 ℃孵育1 h，DAB顯色，自來(lái)水沖洗終止，蘇木精復(fù)染10 min后返藍(lán)，晾干組織切片，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.5 Western blot測(cè)定小腸組織AQP3的表達(dá)：取出各組小鼠小腸組織，在蛋白裂解液中用組織研磨器裂解，冰上放置1 h，4 ℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清液。經(jīng)BCA方法定量后，取40 μg總蛋白與等體積2×上樣緩沖液混合，1 000 ℃煮沸3～5 min變性，上樣于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。常規(guī)轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h。加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。經(jīng)TBST充分洗滌，加入辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)-山羊抗兔抗體室溫反應(yīng)1 h，TBST洗滌，用ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定AQP3的表達(dá)：使用Trizol法提取小鼠小腸組織總RNA，微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA濃度。 將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR檢測(cè)AQP3的表達(dá)，反應(yīng)體系: SYBR Green QPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，cDNA 2 μL, 和引物上下游各0.5 μL。反應(yīng)條件為：90 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，72 ℃ 90 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，計(jì)算平均值。引物如下，AQP3的上游引物序列：5′-GAATCGTTGTGGGGAGATGC-3′；下游引物序列：5′-CCAAAGAGCCCTGTCCCATA-3′；GAPDH的上游引物序列：5′-ACATCATCCCTGCATCCACT-3′，下游引物序列：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。

1.2.7 ELISA檢測(cè)血漿DAO和FABP2水平：取凍存血漿，水浴復(fù)溫，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各標(biāo)本血漿DAO和FABP2表達(dá)水平。每樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3復(fù)孔，獲取酶標(biāo)儀 450 nm處吸光度值(A)，并根據(jù)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本DAO和FABP2含量，取平均值為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥小鼠腸黏膜病理?yè)p傷

CLP術(shù)后，小鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)性下降、疲勞、豎毛現(xiàn)象、腹部滲出液、腹瀉或黏液排出。病理切片分析顯示，CLP后即刻(0 h)的小鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，上皮排列緊密整齊，黏膜及黏膜下無(wú)水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。CLP后光鏡可見小腸黏膜絨毛變細(xì)、變短、排列紊亂、絨毛頂端可見細(xì)胞脫落、缺失；其損傷程度呈CLP后時(shí)間依賴性加重(圖1A)；CLP術(shù)后6、12以及24 h的Chiu’s評(píng)分值呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，均顯著高于0 h(P<0.001)(圖1B)。

2.2 膿毒癥小鼠腸黏膜AQP3表達(dá)下調(diào)

CLP術(shù)后，AQP3表達(dá)下調(diào)，下調(diào)程度呈時(shí)間依賴性，CLP后6、12、以及24 h均顯著低于0 h(P<0.001)(圖2)。

2.3 膿毒癥小鼠血漿DAO和FABP2濃度升高

CLP術(shù)后血漿DAO和FABP2逐漸升高，呈時(shí)間依賴性，術(shù)后6、12、24 h均顯著高于0 h(P<0.001)(圖3)。

2.4 口服甘油治療改善膿毒癥小鼠腸黏膜病理?yè)p傷

假手術(shù)組和假手術(shù)組+口服甘油組小鼠腸黏膜完整，上皮排列緊密；而膿毒癥組和膿毒癥+口服甘油組腸黏膜絨毛明顯受損，絨毛上皮細(xì)胞消失，絨毛皺縮變短?？诜视椭委煵糠指纳菩∧c黏膜病理?yè)p傷(圖4A)；與膿毒癥種組相比，口服甘油后Chiu’s評(píng)分明顯降低(P<0.05)(圖4B)。

A.representative images of intestinal morphology (HE staining, magnification ×200); B.intestinal mucosa injury was quantitative assessed by Chiu’s score；*P<0.001 compared with 0 hour after CLP

A.staining of AQP3 in intestinal tissue sections of septic mice at different times (×200); B.expression of AQP3 mRNA was down-regulated in a time-dependent manner; C.protein expression bands; D.relative express level of AQP3 was down-regulated in a time-dependent manner;*P<0.01,**P<0.001 compared with 0 h group

*P<0.001 compared with 0 hour after CLP group圖3 CLP后各時(shí)間點(diǎn)DAO(A)和FABP2(B)的血漿濃度變化Fig 3 Plasma concentration changes of DAO (A) and FABP2 (B) at each time point after CLP n=6)

A.microscopic findings of the intestines stained with HE 24 hours after CLP in the sham, sham + glycerol, sepsis and sepsis + glycerol groups (magnification ×200); B.intestinal mucosa injury was assessed by Chiu’s score;*P<0.05 compared with sepsis group

2.4 口服甘油治療降低膿毒癥小鼠血漿DAO和FABP2濃度

膿毒癥組和膿毒癥+口服甘油組小鼠DAO和FABP2血漿濃度明顯增高(P<0.001)；口服甘油治療后，與膿毒癥組相比，兩者血漿濃度均降低(P<0.05)(圖5)。

3 討論

腸道屏障損傷是膿毒癥的重要原因。腸道是體內(nèi)最大的細(xì)菌和毒素儲(chǔ)存庫(kù)，CLP后小鼠形成腸瘺，細(xì)菌快速繁殖，并產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素，故膿毒癥發(fā)生急劇、癥狀嚴(yán)重[6]。本研究中，CLP后，小鼠腸黏膜形態(tài)學(xué)受損，表現(xiàn)為腸黏膜絨毛明顯受損，絨毛尖端的上皮細(xì)胞缺失，微絨毛變薄變短。血漿DAO和FABP2濃度是反映腸黏膜結(jié)構(gòu)及通透性較為理想的標(biāo)志因子[8-9]。本研究中，膿毒癥小鼠血漿DAO和FABP2濃度升高，并隨著腸黏膜損傷加重而逐漸升高，提示腸黏膜破壞，通透性增加。

靶向AQP3可調(diào)控膿毒癥患者腸道屏障功能障礙甚至多器官功能障礙[10-11]。結(jié)腸炎小鼠AQP3敲

*P<0.05 compared with sepsis group圖5 甘油治療降低膿毒癥小鼠DAO(A)和FABP2(B)血漿濃度

除后，小鼠結(jié)腸出血、上皮細(xì)胞丟失、細(xì)胞死亡等現(xiàn)象更為嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)CLP后AQP3表達(dá)下調(diào)，并呈時(shí)間依賴性；同時(shí)，腸黏膜病理破壞，通透性增加。

本研究尚不能明確腸黏膜損傷引起AQP3表達(dá)下降，或者相反，兩者可能互為因果?？诜视椭委熌懿糠痔娲鶤QP3功能，改善腸黏膜細(xì)胞損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]。本研究對(duì)膿毒癥小鼠進(jìn)行口服甘油治療，結(jié)果表明口服甘油部分改善膿毒癥所致的腸黏膜損傷。迄今為止，甘油的腸黏膜保護(hù)機(jī)制尚不明確，可能作為黏膜保護(hù)劑發(fā)揮黏膜保護(hù)作用，也可能通過(guò)抑制AQP3下調(diào)而發(fā)揮作用。

結(jié)腸黏膜AQP3表達(dá)水平與腹瀉、便秘密切相關(guān)[12]；大腸桿菌引起小鼠腹瀉過(guò)程中，小腸黏膜AQP3表達(dá)下調(diào)[13]；抗炎藥通過(guò)抑制AQP3表達(dá)減少，能預(yù)防CPT-11誘導(dǎo)的延遲性腹瀉[14]。在本研究中，CLP術(shù)后小鼠出現(xiàn)黏液大便，可能是由于小腸黏膜AQP3表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

本研究結(jié)果為AQP3對(duì)膿毒癥腸道損傷的保護(hù)作用提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的初步依據(jù)，為進(jìn)一步研究提供線索。膿毒癥腸道損傷病理生理機(jī)制復(fù)雜，本研究也存在局限性，口服甘油不能完全替代AQP3，為了進(jìn)一步明確AQP3對(duì)膿毒癥腸黏膜屏障的保護(hù)作用，需要AQP3激動(dòng)/拮抗劑，或者選用AQP3敲除小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。AQP3對(duì)膿毒癥腸黏膜屏障功能保護(hù)作用的機(jī)制也有待于進(jìn)一步研究。