苑曉梅，劉 力

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 病原生物學(xué)系，北京 100005)

白介素23(interleukin 23，IL-23)配體屬于IL-12家族，是由p19和p40亞基組成的異源二聚體，二者分別被IL-23受體(IL-23 receptor，IL-23R)和IL-12Rβ1識(shí)別[1]。活化的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞分泌IL-23配體后，可激活記憶T細(xì)胞產(chǎn)生IL-23R[2]，通過(guò)穩(wěn)定Th17輔助性T細(xì)胞的分化與擴(kuò)增來(lái)促進(jìn)IL-17細(xì)胞因子表達(dá)，也可以通過(guò)激活γδT細(xì)胞和固有淋巴樣細(xì)胞(innate lymphoid cell, ILC)促進(jìn)IL-17分泌[3]。IL-23可促進(jìn)腫瘤發(fā)展進(jìn)程[4]。而本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在人子宮頸癌(HeLa)細(xì)胞系中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染IL-23R可降低IL-23配體的表達(dá)水平，并誘導(dǎo)凋亡增加[5]。

但是，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的效率相對(duì)較低，進(jìn)一步深入研究具有局限性。腺病毒系統(tǒng)感染效率較高，宿主適應(yīng)范圍廣，外源DNA片段容納量較大，易于提高病毒滴度、濃縮和儲(chǔ)存，安全性高[6]。因此，本研究構(gòu)建了表達(dá)白介素23受體的人重組腺病毒(human recombinant adenovirus expressing interleukin 23 receptor，rAd-IL-23R)，并探究其對(duì)HeLa細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系:人子宮頸癌(HeLa)細(xì)胞系、人胚腎細(xì)胞系HEK-293A(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.1.2 主要試劑：BJ5183感受態(tài)細(xì)胞(北京博邁德生物技術(shù)公司)和DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生物科技公司)；SalⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、分子克隆試劑盒(TaKaRa公司)；PmeⅠ和PacⅠ限制性內(nèi)切酶(NEB公司)；質(zhì)粒小提試劑盒(Aidlab公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光液(北京威格拉斯生物技術(shù)公司)；DMEM-高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；小牛血清(NCS)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientificals公司)；anti-β-actin一抗，anti-caspase 3一抗(Proteintech公司)；anti-cleaved-caspase 3一抗(Sigma-Aldrich公司)；anti-IL-23R(Abcam公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑(MCE公司)；凋亡檢測(cè)試劑盒(北京四正柏生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建表達(dá)人IL-23R的重組腺病毒質(zhì)粒：以SalⅠ和XhoⅠ為限制性酶切位點(diǎn)，將IL-23R核酸序列整合入pShuttle-CMV載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建pShuttle-CMV-IL-23R穿梭質(zhì)粒。

pShuttle-CMV-IL-23R穿梭質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ線性化后轉(zhuǎn)化進(jìn)入BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，與骨架載體pAdEasy-1進(jìn)行同源重組(圖1)。重組子經(jīng)過(guò)卡那霉素篩選，挑取10～20個(gè)單克隆擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，隨后分別通過(guò)PacⅠ及SalⅠ/XhoⅠ 酶切進(jìn)行初步鑒定。

選取鑒定正確的pAd-IL-23R質(zhì)粒于DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，隨后提取質(zhì)粒，并進(jìn)行PacⅠ及SalⅠ/XhoⅠ酶切鑒定。

1.2.2 表達(dá)人IL-23R的重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增：pAd-IL-23R經(jīng)PacⅠ線性化回收后，轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，1周后收取細(xì)胞及培養(yǎng)基，反復(fù)凍融3次，離心收集上清rAd-IL-23R病毒液。采用rAd-IL-23R病毒液繼續(xù)感染HEK-293A細(xì)胞，約3 d收取細(xì)胞及培養(yǎng)基，繼續(xù)反復(fù)凍融3次，離心收集上清rAd-IL-23R病毒液，此時(shí)rAd-IL-23R病毒滴度有所提升，重復(fù)此操作，直至出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)，表現(xiàn)為細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變大變圓、脫落，呈葡萄串狀等異常生長(zhǎng)變化。rAd-GFP病毒液采用同樣方法提升病毒滴度。

1.2.3 病毒滴度測(cè)定：采用TCID50法測(cè)定病毒滴度。HEK-293A細(xì)胞接種于96孔板，rAd-IL-23R病毒液進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀釋后感染293A細(xì)胞，每個(gè)梯度設(shè)置10個(gè)復(fù)孔，剩余16孔做為陰性對(duì)照；rAd-GFP病毒液進(jìn)行同樣操作。定期在顯微鏡下觀察并補(bǔ)充培養(yǎng)基，7～10 d待不再出現(xiàn)新的CPE時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)病毒稀釋液梯度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，采用KARBER統(tǒng)計(jì)法計(jì)算TCID50滴度T=1+d(S-0.5) /100 μL。d=lg稀釋度，本實(shí)驗(yàn)稀釋度為10，故d=1；S=陽(yáng)性比率之和。

圖1 pShuttle-CMV-IL-23R和pAdEasy-1重組示意圖Fig 1 Recombinant diagram of pShuttle-CMV-IL-23R and pAdEasy-1

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染：在37 ℃ 5% CO2的潮濕環(huán)境中，采用10%小牛血清加DMEM培養(yǎng)HeLa細(xì)胞和HEK-293A細(xì)胞。將細(xì)胞接種于12孔板或96孔板，24 h后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，并加入病毒孵育4 h，隨后補(bǔ)充血清至完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平：收集病毒感染24 h后的細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液在冰上裂解并提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白液濃度，制備樣品依次進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中37 ℃封閉1 h，在4 ℃條件下與一抗雜交過(guò)夜，室溫二抗雜交1 h，最終加入ECL發(fā)光液檢測(cè)細(xì)胞中相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1.2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):等量HeLa細(xì)胞接種于96孔板，次日接種病毒，24 h后加入CCK-8試劑37 ℃孵育2 h，在450 nm下測(cè)量吸光度值。使用計(jì)數(shù)后的HeLa細(xì)胞，梯度稀釋后進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算細(xì)胞增殖數(shù)目，每組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。

1.2.7 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):感染病毒24 h后，收集2×105～5×105/mL HeLa細(xì)胞，PBS輕柔洗滌，在1×結(jié)合緩沖液中用annexin Ⅴ-FITC室溫避光染色10 min，隨后加入 PI染色，采用流式細(xì)胞儀在1 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 pAd-IL-23R質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的鑒定

2個(gè)pAd-IL-23R質(zhì)粒1、2及其酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，第3、4泳道的PacⅠ單酶切產(chǎn)物大小分別為～30 kb和3.0 kb，第5、6泳道的SalⅠ/XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物大小包括1.89 kb，與預(yù)測(cè)相符，說(shuō)明pAd-IL-23R質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

M.DNA marker (DL 15 000); 1,2.showed the sizes of pAd-IL-23R plasmids; 3,4.showed the sizes of PacⅠ enzyme-digested products of pAd-IL-23R plasmids; 5,6.showed the sizes of SalⅠ/XhoⅠ enzyme-digested products of pAd-IL-23R plasmids圖2 pAd-IL-23R質(zhì)粒及其酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig 2 Agarose gel electrophoresis of pAd-IL-23R plasmids and enzyme-digested products

2.2 rAd-IL-23R滴度測(cè)定及其在HEK-293A細(xì)胞中的表達(dá)

HEK-293A細(xì)胞感染rAd-IL-23R后出現(xiàn)CPE，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變大變圓，呈葡萄串狀(圖3A)，測(cè)定rAd-IL-23R和rAd-GFP的病毒滴度分別為106.5TCID50/mL和107.5TCID50/mL。隨著rAd-IL-23R感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的增加，HEK-293A細(xì)胞中IL-23R的表達(dá)量也隨之增高(圖3B)。

2.3 rAd-IL-23R對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

以2 MOI的rAd-GFP做為陰性對(duì)照組，rAd-IL-23R對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖呈顯著的劑量依賴性抑制作用(圖4)。

2.4 rAd-IL-23R對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

隨著rAd-IL-23R MOI的增高，HeLa細(xì)胞的凋亡率明顯增加(P<0.05)(圖5A，5B)；且隨著IL-23R蛋白表達(dá)量的增加，caspase 3被激活，表現(xiàn)為caspase 3前體的表達(dá)量降低，而被切割后的cleaved-caspase 3表達(dá)水平顯著增高，具有明顯的劑量效應(yīng)(圖5C)。

3 討論

IL-23與IL-23R結(jié)合后可激活Janus激酶(Janus kinases，JAK2)，進(jìn)而誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducers and activators of transcrip-tion factor，STAT)、有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol kinase 3-kinase，PI3Ks)信號(hào)的下游效應(yīng)分子[7]，同時(shí)還可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路的激活發(fā)揮效應(yīng)[8]。IL-23/IL-23R對(duì)啟動(dòng)、維持和加速I(mǎi)L-23/IL-17炎性反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路至關(guān)重要，參與維持慢性炎性反應(yīng)進(jìn)展及腫瘤形成[9]。Blaine等[10]發(fā)現(xiàn)IL-23R敲除小鼠中Th17的表型減少，從而加速口腔癌的癌前病變進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)IL-23R在宮頸癌細(xì)胞中同樣可發(fā)揮抑癌樣基因作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。癌前病變時(shí)DNA損傷引起的細(xì)胞凋亡有助于清除有害細(xì)胞，阻止腫瘤發(fā)生；而凋亡功能紊亂可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，與細(xì)胞增殖失控、 腫瘤進(jìn)展和治療耐藥相關(guān)，因此，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性可能有助于疾病治療[11]。

A.morphological changes of 293A cells that were mock-infected or infected with rAd-IL-23R(×10); B.Western blot analysis on the expression of the IL-23R treated with different MOI of rAd-IL-23R； β-actin was included as a internal control

圖3 rAd-IL-23R對(duì)293A細(xì)胞形態(tài)及蛋白表達(dá)的影響
Fig 3 Effect of rAd-IL-23R on phenotype and protein expression of 293A cells

*P<0.05, **P<0.01 compared with rAd-GFP group圖4 rAd-IL-23R對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響Fig 4 Effect of rAd-IL-23R on proliferation of

實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)主要適用于體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)于后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)仍具有一定局限性。腺病毒載體是一種在體內(nèi)外傳遞表達(dá)基因的有效方式，可以在分裂、休眠及終末分化任一時(shí)期的細(xì)胞中穩(wěn)定高表達(dá)，此外，腺病毒不整合到宿主基因組，且免疫原性相對(duì)較低[6]。綜合治療方式及臨床表現(xiàn)，腺病毒載體藥物在基因治療方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，是目前臨床實(shí)驗(yàn)中最常見(jiàn)的治療載體之一[12]。

A, B.flow cytometric analysis on apoptosis of HeLa cells;*P<0.01 compared with blank control group; C.Western blot analysis on the expression of caspase 3, cleaved-caspase 3 and IL-23R; expressions of β-actin were served as internal controls; data was the one representive of at least two independent experiments with similar results

本研究采用AdEasyTM系統(tǒng)，將攜有IL-23R的穿梭載體與腺病毒骨架載體進(jìn)行同源重組，成功構(gòu)建了人重組腺病毒rAd-IL-23R，該病毒可感染人子宮頸癌(HeLa)細(xì)胞系，且呈劑量依賴性抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，這為進(jìn)一步深入探索IL-23R在宮頸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能提供了研究基礎(chǔ)。