劉敏雪，黃麗英，梁嘉慧，曾尚娟，岑貞嬌，李萌，黃戰(zhàn)，阮佳玲，張歡，王雙杰

1. 廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院， 南寧 530000； 2. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 南寧 530021

鹽單胞菌屬于革蘭陰性桿菌，有嗜鹽特性，目前發(fā)現(xiàn)的鹽單胞菌有30余種。大多鹽單胞菌是從海洋、鹽湖等含鹽水環(huán)境中分離得到[1-7]。20世紀(jì)初，國(guó)外曾報(bào)道過(guò)幾例鹽單胞菌引起人類(lèi)感染，其感染癥狀主要為發(fā)熱、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)升高，可伴有肺部炎癥[7-8]。但目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)鹽單胞菌感染相關(guān)報(bào)道。本文報(bào)道1例嬰幼兒血流感染鹽單胞菌病例，患兒感染癥狀典型。來(lái)自該患兒的鹽單胞菌生長(zhǎng)速度慢，常規(guī)生化、質(zhì)譜方法數(shù)據(jù)庫(kù)局限而難以鑒定，最終經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序，確定為鹽單胞菌。臨床醫(yī)師根據(jù)該鹽單胞菌的藥物敏感(藥敏)情況給予藥物治療后，患兒病情好轉(zhuǎn)。詳情報(bào)道如下。

1 臨床材料

1.1 病例

患兒，男，年齡2個(gè)月24天。因發(fā)現(xiàn)皮下出血點(diǎn)3 d，就診于廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院。入院時(shí)主要癥狀及體征：全身出現(xiàn)皮下出血點(diǎn)，以眼瞼為著；呼吸急促，有三凹征，雙側(cè)呼吸運(yùn)動(dòng)對(duì)稱(chēng)；雙肺呼吸音粗，聞及痰鳴音。

1.1.1 血常規(guī)檢查門(mén)、急診檢查血小板 7×109/L↓，入院時(shí)白細(xì)胞13.0×109/L↑，血小板4×109/L↓。

1.1.2 凝血功能檢查纖維蛋白原(fibrinogen, FIB)1.78 g/L↓，凝血酶時(shí)間(thrombin time, TT)18.5 s↑，D-二聚體 1 056 μg/L↑。入院后，前3 d CRP由0.5 mg/L逐漸升高至12.6 mg/L。

1.1.3 免疫學(xué)檢驗(yàn)報(bào)告顯示, 抗雙鏈DNA抗體IgG(定性)陽(yáng)性。

1.1.4 骨髓穿刺鏡檢結(jié)果顯示骨髓增生活躍，粒系增生活躍，紅系增生活躍，血小板少見(jiàn)，巨核細(xì)胞產(chǎn)血小板功能減低。

1.1.5 肺部CT報(bào)告提示支氣管肺炎。

1.1.6 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)抗生素使用前、后分別送檢痰培養(yǎng)。結(jié)果顯示，無(wú)致病菌生長(zhǎng)。入院輸血前及抗生素使用前進(jìn)行血培養(yǎng)(兒童瓶，單次)，0.54 d報(bào)告陽(yáng)性；將血培養(yǎng)陽(yáng)性液涂片革蘭染色，鏡檢顯示為革蘭陰性桿菌；繼續(xù)轉(zhuǎn)種至血平板與巧克力平板，于5% CO2孵箱培養(yǎng)，48 h無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。其余無(wú)特殊異常。

對(duì)該病例的診斷：① 免疫性血小板減少癥；② 重癥肺炎；③ 呼吸衰竭；④ 感染性休克；⑤ 心力衰竭；⑥ 重度貧血。臨床治療：輔助通氣改善呼吸衰竭；輸注同型去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞改善貧血，輸注冷沉淀、新鮮冰凍血漿、單采血小板糾正凝血功能障礙；激素治療。入院后，前4 d經(jīng)驗(yàn)性給予美羅培南抗感染，美羅培南治療期間體溫在37.6～38.2 ℃ 波動(dòng)，白細(xì)胞降至6.2×109/L，之后抗生素改用哌拉西林/他唑巴坦治療。住院8 d后，體溫降至 36.8 ℃，感染指標(biāo)CRP降至0.89 mg/L，血小板升至859×109/L，好轉(zhuǎn)出院。

1.2 儀器和方法

1.2.1 儀器BacT/ALERT3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀、VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析儀和配套革蘭陰性(Gram negative, GN)菌鑒定卡、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)為法國(guó)梅里埃生物公司產(chǎn)品，DL-96為珠海迪爾生物工程有限公司產(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)肉湯、哥倫比亞血平板及巧克力平板購(gòu)自廣州迪景微生物科技有限公司，快速革蘭染色液購(gòu)自成都瑞琦科技實(shí)業(yè)股份有限公司，S1000TMThermal Cycler PCR儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2.2 方法采集患兒4 mL靜脈血，注入兒童血培養(yǎng)瓶中，置于BacT/ALERT3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀進(jìn)行培養(yǎng)，將報(bào)告陽(yáng)性的培養(yǎng)液涂片革蘭染色后鏡檢。并將血培養(yǎng)陽(yáng)性液轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血平板及巧克力平板，置35 ℃、5% CO2中培養(yǎng)；取0.5 mL血培養(yǎng)陽(yáng)性液加入2 mL無(wú)菌肉湯，置35 ℃、5% CO2中孵育，每隔24 h觀察1次培養(yǎng)情況。采用 VITEK 2 Compact及DL-96全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析儀對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。用加熱煮沸法提取細(xì)菌DNA，即用無(wú)菌接種環(huán)挑取2～3個(gè)單個(gè)菌落，置于1 mL無(wú)菌去離子水中，100 ℃加熱20 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為基因擴(kuò)增模板。16S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序送北京睿博興科公司進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡檢查

血培養(yǎng)陽(yáng)性液涂片染色鏡檢觀察到寬大革蘭陰性微彎桿菌(圖1)。按常規(guī)流程于孵育24 h及48 h后觀察血平板及巧克力平板培養(yǎng)情況，均未見(jiàn)菌體生長(zhǎng)。采用增加肉湯增菌法實(shí)驗(yàn)以傳代返祖：取0.5 mL血培養(yǎng)陽(yáng)性液，加入2 mL無(wú)菌肉湯，置35 ℃、5% CO2中孵育。同時(shí)延長(zhǎng)平板培養(yǎng)時(shí)間，每隔24 h觀察1次培養(yǎng)情況。巧克力平板孵育至第5天時(shí)，觀察到一區(qū)有濕潤(rùn)、黏液狀、凸起、完整、反光、微黃透明菌落生長(zhǎng)(圖2)；將菌落涂片革蘭染色，鏡下形態(tài)與圖1血培養(yǎng)液涂片鏡下形態(tài)一致。另外，肉湯孵育24 h后，見(jiàn)紅色絮狀沉淀(圖3)，取肉湯培養(yǎng)液，再轉(zhuǎn)種至血平板及巧克力平板，置35 ℃、5% CO2中孵育24 h后血平板及巧克力平板亦長(zhǎng)出菌落，其形態(tài)與圖2菌落形態(tài)一致；將菌落涂片革蘭染色，鏡下形態(tài)與圖1血培養(yǎng)液涂片鏡下形態(tài)一致。

圖1 顯微鏡下菌體形態(tài)為寬大革蘭陰性微彎桿菌(1 000×)

圖2 巧克力平板孵育5 d菌落形態(tài)

圖3 肉湯增菌后見(jiàn)絮狀沉淀物

2.2 生化及質(zhì)譜鑒定

該菌氧化酶、觸酶陽(yáng)性，在6.5% NaCl培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)，生化反應(yīng)不活躍。VITEK 2 Compact儀鑒定為玫瑰假單胞菌，鑒定率為67.63%；DL-96鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌，鑒定率為99.15%，2種儀器鑒定結(jié)果差別大。VITEK 2 Compact儀鑒定率不高，而該菌的菌落形態(tài)與洋蔥伯克霍爾德菌的常見(jiàn)菌落形態(tài)不同，故對(duì)2種儀器鑒定結(jié)果持懷疑態(tài)度。另外，對(duì)菌種進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，亦未鑒定出。

2.3 藥敏試驗(yàn)

由于美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)暫無(wú)此菌藥敏解釋標(biāo)準(zhǔn)，因此參照 2018年CLSI-100中非腸桿菌科菌藥敏折點(diǎn)[9]，DL-96 NE藥敏板顯示陽(yáng)性孔生長(zhǎng)，其對(duì)哌拉西林最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)>128 μg /mL，判為耐藥；對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、美洛培南、亞胺培南及米諾環(huán)素敏感。VITEK 2 Compact GN13卡藥敏結(jié)果顯示，其對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明均敏感。

2.4 16S rRNA基因測(cè)序鑒定

對(duì)該菌進(jìn)行靶向DNA測(cè)序，16S rRNA基因擴(kuò)增采用廣譜引物：27f (5′-AGAGTTTGATCCT-GGCTCAG-3′)與1492r(5′-GGTTACCTTGTT-ACGACTT-3′)[10]。結(jié)果可見(jiàn)單一、清晰的目的條帶，與嗜鹽單胞菌屬(Halomonassp.)序列相似度高，為99.04%，與亞硝酸鹽單胞菌相似度為98.58%，兩者相似度未>0.8%，所以基因測(cè)序僅鑒定到嗜鹽單胞菌屬，部分測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4。

3 討論

瑞士2000年首次報(bào)道1例人被魚(yú)咬傷后感染鹽單胞菌的病例[7]，其感染癥狀僅為傷口紅腫，CRP升高，而體溫及血白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常。醫(yī)院內(nèi)首次暴發(fā)鹽單胞菌血流感染于1999—2000年，地點(diǎn)為突尼斯軍隊(duì)醫(yī)院新生兒危重病房[8]，文獻(xiàn)報(bào)道提及的新生兒鹽單胞菌血流感染癥狀為發(fā)熱、CRP升高，部分伴隨肺部感染，臨床醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)性給予美羅培南治療后好轉(zhuǎn)。本文報(bào)道的患兒癥狀與文獻(xiàn)報(bào)道的部分相似[8]，即發(fā)熱、CRP升高，伴有肺部炎癥。但不同的是，本報(bào)告的患兒出現(xiàn)血小板減少癥狀，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查懷疑免疫性血小板減少可能性大。根據(jù)文獻(xiàn) 報(bào)道[11-14]，血流感染可能伴隨血小板減低，故該患者并不能排除鹽單胞菌血流感染進(jìn)一步加重血小板減低的可能。也有可能是免疫性血小板減低使患兒免疫力低下，導(dǎo)致感染的可能性增大。本報(bào)告檢出的鹽單胞菌藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示，該菌除對(duì)哌拉西林耐藥外，對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)及碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感，與突尼斯相關(guān)報(bào)道相符[8]。而本病例中臨床醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)性使用美羅培南和哌拉西林/他唑巴坦抗感染治療有效，且與藥敏結(jié)果相符，也佐證了這一結(jié)果。

圖4 16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果

本文報(bào)道對(duì)象為嬰兒，入院后3 h送檢血培養(yǎng)，經(jīng)孵育12 h報(bào)告陽(yáng)性，從血培養(yǎng)送檢時(shí)間推測(cè)，由本次入院引起的院內(nèi)感染可能性小，且血培養(yǎng)曲線陡峭向上，推測(cè)血培養(yǎng)瓶中菌量較大。嬰幼兒皮脂厚，消毒要求高，其血培養(yǎng)采血時(shí)較成人更容易出現(xiàn)皮膚定植菌污染，但鹽單胞菌并非皮膚常見(jiàn)定植污染菌，故推測(cè)采血造成血培養(yǎng)污染的可能性小。由于患兒未送檢第2套血培養(yǎng)，所以對(duì)鹽單胞菌引起血流感染的初步診斷結(jié)果未能進(jìn)一步驗(yàn)證，建議嬰幼兒血培養(yǎng)應(yīng)嚴(yán)格按照指南要求操作[15-17]。嬰幼兒飲食單一，且不能自主大范圍活動(dòng)，感染途經(jīng)局限。本病例未能進(jìn)行患兒母親的血培養(yǎng)檢測(cè)，患兒或許在其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)接種疫苗或就醫(yī)時(shí)感染鹽單胞菌亦不能排除。

綜上所述，本文報(bào)道結(jié)果提示，鹽單胞菌鏡下形態(tài)為寬大微彎陰性桿菌；其生長(zhǎng)緩慢，需延長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)；對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類(lèi)及碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感；需通過(guò)分子診斷技術(shù)做出鑒定，而應(yīng)用生化及MALDI-TOF MS方法則不能。本文報(bào)道病例對(duì)實(shí)驗(yàn)室診斷、臨床治療鹽單胞菌感染具有一定的指導(dǎo)意義。