魏明童，夏兵兵，何志遠(yuǎn)，周煒，劉興東，趙俊,，陳敬賢，王明麗,

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230060； 2. 蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司, 蕪湖 241000； 3. 安徽醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院, 合肥 230060； 4. 安徽醫(yī)科大學(xué)臨床病毒學(xué)研究所, 合肥 230032

水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)為雙鏈DNA病毒，屬皰疹病毒α亞科。VZV主要通過呼吸道傳播，在人類原發(fā)感染時(shí)可引起水痘并在人脊髓神經(jīng)節(jié)中終身潛伏，當(dāng)宿主免疫力低下時(shí)病毒可再次被激活導(dǎo)致帶狀皰疹(herpes zoster, HZ)[1, 2]。HZ在我國年發(fā)病率約為3.4/1 000～5.8/1 000[3]，并且在50歲以上人群中發(fā)病率急劇上升[4]。HZ導(dǎo)致的后遺神經(jīng)痛等并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[5]，而且目前無治療HZ特效藥，臨床上以對(duì)癥治療為主。VZV糖蛋白E(glycoprotein E， gE)由開放閱讀框(open reading frames，ORF)68基因編碼，全長為 1 872 bp，其N端第1～544氨基酸殘基為含有信號(hào)肽的胞外域[6]，第121～135氨基酸殘基為產(chǎn)生中和抗體的抗原表位[7]。gE為病毒包膜和感染細(xì)胞膜上含量最豐富的糖蛋白[8]，具有促進(jìn)病毒復(fù)制增殖以及介導(dǎo)病毒在細(xì)胞間傳播的功能[9]。gE基因序列高度保守，抗原性穩(wěn)定并且具有很強(qiáng)的免疫原性[10, 11]，是VZV亞單位疫苗的主要候選蛋白。

葛蘭素史克(GlaxoSmithKline, GSK)公司的VZV gE亞單位疫苗Shingrix于2017年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(U. S. Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)用于預(yù)防帶狀皰疹，其在臨床試驗(yàn)中獲得良好的預(yù)防效果，這說明采用gE亞單位疫苗具有可行性和優(yōu)越性。Shingrix由于使用真核表達(dá)系統(tǒng)(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)生產(chǎn)，其產(chǎn)量較低、價(jià)格較高。我國2019年5月批準(zhǔn)Shingrix疫苗在中國上市，但到目前為止仍未見廣泛使用。目前采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組VZV gE蛋白均為包涵體形式，故后續(xù)工藝需要變復(fù)性處理，操作步驟較復(fù)雜，且變復(fù)性可能影響該蛋白的結(jié)構(gòu)與活性。因此，研究重組VZV gE蛋白原核可溶性表達(dá)可充分發(fā)揮原核表達(dá)系統(tǒng)工藝簡單、成本低等優(yōu)勢，為VZV gE亞單位疫苗研制提供一種新的方案。

伊興旭等[12]通過原核表達(dá)系統(tǒng)以包涵體形式表達(dá)的重組VZV gE蛋白具有一定的特異性，免疫家兔可得到相應(yīng)特異性較強(qiáng)的多克隆抗體。因此在參考其研究的基礎(chǔ)上，本研究通過分析VZV gE 第31～539氨基酸殘基信號(hào)肽、親水性等理化性質(zhì)和抗原表位后，采用VZV gE去除信號(hào)肽的胞外域序列，以原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建并表達(dá)重組gE蛋白，進(jìn)一步鑒定其免疫反應(yīng)性及產(chǎn)生抗體的特異性，期望對(duì)VZV gE亞單位疫苗研制提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、人胚成纖維細(xì)胞(HF)、非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞、VZV(OKA株)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV，AD169 株)、單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV) 1型(HSV-1，F(xiàn) 株)及HSV-2型(HSV-2，Sav株)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。6～8周齡BALB/c小鼠(SPF級(jí)，體重22～25克/只)購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。pET32a-VZV gE重組質(zhì)粒由安徽省滁州通用生物公司合成。限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ購自大連Takara公司。小鼠抗VZV gE單克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購自美國Invitrogen公司；4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)購自北京索萊寶科技有限公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國 SIGMA 公司。含有氨芐西林(ampicillin, Amp+)的瓊脂培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室制備。質(zhì)粒提取試劑盒購自美國AXYGEN公司。EtEraserTM HP 內(nèi)毒素去除試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技有限公司。熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。蛋白純化儀(AKTA)購自上海宸喬生物科技有限公司，Ni Sepharose 6 Fast Flow 親和層析柱和HiPrepTM Q FF 16/10陰離子交換預(yù)裝柱購自美國GE公司，0.45 μm針形濾器購自美國Millipore公司，酶標(biāo)儀(iMark)購自美國Bio-Rad公司，化學(xué)發(fā)光成像儀(ChemiScope 5200)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 VZV gE胞外域生物信息學(xué)分析基因序列來源于美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)ID: 1487709，在伊興旭等[12]的研究基礎(chǔ)上，去除第1～30氨基酸序列，目的基因大小 1 527 bp。引物設(shè)計(jì)：Sense：5′-GCCTTACTACCATTCAGATC-3′；Antisense：5′-GTGTATGCTACGGCTTCA-3′。用ExPASy在線工具(www.expasy.org)分析VZV gE第31～539氨基酸殘基序列的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、疏水性及三級(jí)空間結(jié)構(gòu)，通過德泰生物在線工具(www.detaibio.com)預(yù)測其抗原表位。

1.2.2 BL21/pET32a-VZV gE工程菌構(gòu)建及鑒定將10 μL pET32a-VZV gE重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至100 μL BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴45 min后置42 ℃水浴熱激90 s，熱激完成后冰浴3～5 min。加入1 mL的溶菌肉湯(lysogeny broth， LB)培養(yǎng)液，置搖床37 ℃溫浴1 h，離心去除上清液，將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞接種至含Amp+瓊脂培養(yǎng)基平皿上。37 ℃培養(yǎng)12～16 h后，挑取單菌落接種到含Amp+液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)及雙酶切，并交由北京六合華大基因科技有限公司測序鑒定。PCR體系為25 μL，包括1 μL pET32a-VZV gE質(zhì)粒模板，Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各 0.5 μL 和RNase free H2O 10.5 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，60 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸2 min，共39個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min。雙酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒模板15 μL，BamH Ⅰ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶各1.5 μL，10×QuickCut 緩沖液 2 μL，用RNase free H2O 配制成終體積為 20 μL 體系，37 ℃反應(yīng)1 h。

1.2.3 重組gE蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性檢測將BL21/pET32a-VZV gE重組菌置于LB液體培養(yǎng)基(Amp+)中37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，30 ℃誘導(dǎo)，分別在第2、4、6、8、10、12 h收集1 mL菌液，12 000 rpm離心收集沉淀物，300 μL 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)重懸，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和Gis軟件分析檢測重組gE蛋白表達(dá)情況。重組菌擴(kuò)增培養(yǎng)至OD600值等于0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)8 h，7 000 r/min 離心20 min，使用PBS重懸菌體，冰浴超聲破碎菌體，12 000 r/min離心5 min分離上清液和沉淀物，分別取上清液、沉淀物及破碎前菌體經(jīng)SDS-PAGE檢測重組gE蛋白的可溶性。

1.2.4 重組gE蛋白純化、去內(nèi)毒素以及特異性檢測將重組菌超聲破碎，12 000 r/min離心5 min，取上清液后，使用His-tag親和層析柱對(duì)重組gE蛋白進(jìn)行純化后，將收集洗脫下的目的蛋白溶液去除內(nèi)毒素，即取VZV gE蛋白溶液置于20倍柱體積PBS中，4 ℃透析6 h以上。采用HiPrepTM Q FF 16/10預(yù)裝柱，超純水沖洗層析柱至出液端液體pH值為中性。平衡緩沖液(50 mmol/L乙酸鈉，pH=5.0)平衡層析柱，再使用冰乙酸快速調(diào)節(jié)重組gE蛋白純化產(chǎn)物pH值至5.0±0.2，12 000 r/min離心5 min后收集上清液。經(jīng)0.45 μm針形濾器過濾后，過HiPrepTM Q FF 16/10預(yù)裝柱去除內(nèi)毒素，待UV 280 nm吸收值開始上升時(shí)收樣，收集流穿液，即為去除內(nèi)毒素后的重組gE蛋白。采用EtEraserTM HP 內(nèi)毒素去除試劑盒，按照操作方法檢測該重組蛋白溶液的內(nèi)毒素含量。以蛋白質(zhì)印跡法(Western blot, WB)鑒定其特異性，即以小鼠抗VZV gE單克隆抗體(1∶4 000 稀釋)為一抗，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶50 000稀釋)為二抗，37 ℃孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min。最后使用化學(xué)發(fā)光成像儀觀察結(jié)果。

1.2.5 重組gE蛋白的多克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)用6～8周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠50只，體重為22～25克/只，隨機(jī)平均分為5組(組號(hào)：1、2、3、4、5)。免疫前小鼠尾靜脈采血保存作為陰性血清對(duì)照。初次免疫時(shí)，每只小鼠腹腔注射0.2 mL由弗氏完全佐劑乳化的純化gE抗原(蛋白濃度為1.0 mg/mL)。第3和第5周以弗氏不完全佐劑乳化的純化抗原進(jìn)行免疫，最后以無佐劑純化抗原再進(jìn)行2次免疫，每次間隔2周。每次免疫后1周內(nèi)經(jīng)小鼠眼眶靜脈采血，分別收集血清備用。

1.2.7 間接免疫熒光法檢測多克隆抗體的特異性將HF細(xì)胞和Vero細(xì)胞分別接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長滿單層，分別取VZV、人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染HF細(xì)胞，HSV-1、HSV-2感染Vero細(xì)胞，置 37 ℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)。待出現(xiàn)病毒特征性致細(xì)胞病變后，用固定液(甲醛與丙酮體積比為1∶1)固定細(xì)胞，室溫作用10 min，PBS洗滌3次，每次5 min(以下各步驟間均用相同方法洗滌)；1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)處理細(xì)胞10 min，10%小牛血清封閉1 h；以1∶500稀釋的小鼠抗血清作為一抗，37 ℃ 孵育1 h；然后用1∶4 000 稀釋的Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG作為二抗，37 ℃孵育1 h；加入0.5 μg/mL DAPI在室溫染色10 min，洗滌、蓋片，置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 VZV gE第31～509氨基酸殘基為親水蛋白且抗原表位豐富

使用ExPASy在線工具分析VZV gE第31～539氨基酸殘基信號(hào)肽、跨膜區(qū)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性，使用德泰生物在線工具預(yù)測該序列抗原表位。結(jié)果表明，該序列不含信號(hào)肽序列和跨膜區(qū)；其三級(jí)結(jié)構(gòu)由規(guī)則的空間構(gòu)象組成，包括多個(gè)β折疊和無規(guī)則卷曲(圖1A)；對(duì)該序列進(jìn)行親水性預(yù)測發(fā)現(xiàn)，它由509個(gè)氨基酸殘基組成，只有少數(shù)疏水區(qū)域，預(yù)測結(jié)果為親水蛋白；同時(shí)得到gE第31～539氨基酸殘基抗原表位預(yù)測信息，即該全長序列中有豐富的抗原表位且位點(diǎn)的抗原指數(shù)較高(圖1B)。

2.2 pET32a-VZV gE重組質(zhì)粒含有目的基因序列

將BL21/pET32a-VZV gE工程菌擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切后，交由北京六合華大基因科技有限公司測序鑒定。鑒定結(jié)果顯示，pET32a-VZV gE重組質(zhì)粒中含有去除第1～30氨基酸序列的VZV gE胞外域基因序列。

2.3 重組gE蛋白可溶性表達(dá)檢測

重組菌經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，通過電泳圖譜分析發(fā)現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，重組gE蛋白表達(dá)量不斷增加，在第8小時(shí)時(shí)表達(dá)量趨向峰值，條帶為43.07%(圖2A)。重組菌經(jīng)超聲破碎后，取上清液和沉淀物進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上清液樣本泳道中，相對(duì)分子質(zhì)量(molecular weight, MW)約77.6×103處出現(xiàn)明顯的目的條帶，而沉淀物樣本中目的條帶較淺，表明重組gE蛋白主要為可溶性表達(dá)(圖2B)。

A: Tertiary structure prediction of recombinant gE protein. B: Prediction of antigen epitopes of recombinant gE protein.

2.4 重組gE蛋白純化產(chǎn)物的特異性檢測

重組gE蛋白純化并去除內(nèi)毒素后，經(jīng)檢測內(nèi)毒素含量<5 EU/mL。經(jīng)SDS-PAGE鑒定和Gis軟件分析，該重組蛋白溶液的純度約90%(圖3A)。進(jìn)一步采用以小鼠抗VZV gE單克隆抗體(1∶4 000稀釋)為一抗的WB技術(shù)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示純化的重組gE蛋白實(shí)驗(yàn)組在MW約為77.6×103處出現(xiàn)明顯的優(yōu)勢條帶，提示重組gE蛋白具有較強(qiáng)的特異性(圖3B)。

2.5 小鼠血清抗VZV gE多克隆抗體效價(jià)測定

2.6 小鼠抗VZV gE多克隆抗體的特異性鑒定

制備VZV和HCMV感染的HF細(xì)胞片及HSV-1、HSV-2感染的Vero細(xì)胞片，以重組gE抗原免疫小鼠制備的相應(yīng)特異性多克隆抗體作為一抗(1∶500稀釋)、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG作為二抗(1∶4 000 稀釋)進(jìn)行間接免疫熒光染 色反應(yīng)。結(jié)果顯示，VZV感染的HF細(xì)胞膜呈現(xiàn)典型的綠色熒光著色；而其他皰疹病毒感染的細(xì)胞膜均未出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)(圖4)。這提示用重組gE蛋白制備的多克隆抗體具有高度特異性。

A: SDS-PAGE detected the expression of recombinant gE protein induced at different time. M: Protein Marker 26610; 1: BL21/pET32a-VZV gE recombinant bacteria before induction; 2-7: Followed by inducted 2, 4, 6, 8, 10 and 12 h. B: The expression of recombinant gE protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis. M: Protein Marker 26610; 1: BL21/pET32a-VZV gE recombinant bacteria before induction; 2: Recombinant bacteria were not lysised after induction; 3: Supernatant of bacterial lysates; 4: Precipitation of bacterial lysates.

A: SDS-PAGE results of recombinant gE protein purified product. M: Protein marker 26610; 1: BL21/ pET-32a negative control; 2: Recombinant gE protein purified product. B: Results of WB identification of recombinant gE protein purified product. M: Protein marker26616; 1: BL21/pET-32a negative control; 2: Recombinant gE protein purified product.

表1 小鼠血清抗VZV gE多克隆抗體水平

3 討論

VZVgE胞外域主要含有3個(gè)抗原表位，分別位于第56～75、第86～105和第116～135氨基酸殘基[13]。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，gE蛋白N端的信號(hào)肽因無法被相應(yīng)受體識(shí)別而失去其作用，并且其疏水性可能會(huì)導(dǎo)致gE蛋白的錯(cuò)誤折疊從而影響蛋白表達(dá)。在pET32a質(zhì)粒中，Trx含有原核表達(dá)系統(tǒng)的信號(hào)肽且對(duì)人體無毒副作用[14]。因此，采用去除信號(hào)肽的gE胞外域序列構(gòu)建的BL21/pET32a-VZV gE重組菌可能有助于重組gE蛋白重要抗原表位的可溶性表達(dá)。這可能是本研究所獲目的蛋白能夠保持較高免疫原性的原因之一。但本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理時(shí)，未對(duì)臨界值附近標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，這是此次實(shí)驗(yàn)研究中存在的不足，今后還將進(jìn)一步改進(jìn)和完善。

HZ多發(fā)于老年人以及免疫缺陷患者，細(xì)胞免疫功能的降低是HZ發(fā)病的重要因素[15]。gE豐富表達(dá)于VZV和其感染的細(xì)胞表面，是VZV特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)的主要靶點(diǎn)[16]。VZV gE亞單位疫苗Shingrix良好的臨床免疫效果得益于其使用的AS01B佐劑能夠有效協(xié)助抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生VZV gE特異性CD4+T細(xì)胞，從而引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答[17, 18]。所以國產(chǎn)VZV gE亞單位疫苗的研發(fā)應(yīng)當(dāng)重視不同的佐劑產(chǎn)生的效力，有效的佐劑不僅在先期接種時(shí)強(qiáng)化疫苗產(chǎn)生的免疫效果， 同時(shí)有助于提高機(jī)體的免疫記憶能力，使機(jī)體隨著年齡增長仍能保持對(duì)VZV特異性免疫應(yīng)答能力。

真核表達(dá)系統(tǒng)具有磷酸化和糖基化等修飾功能[19，20]，可提高蛋白的活性和免疫原性，但由于其生產(chǎn)周期長和成本高等因素的限制，目前上市的VZV疫苗Shingrix產(chǎn)能相對(duì)不足。由于我國每年有近300萬人受HZ影響，使得疫苗的需求壓力較大，盡快研發(fā)出國產(chǎn)疫苗迫在眉睫。本研究構(gòu)建的原核系統(tǒng)表達(dá)的重組gE蛋白在保持其有較強(qiáng)的免疫原性的同時(shí)，還具備工藝相對(duì)簡單、生產(chǎn)成本低、可大規(guī)模發(fā)酵和工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢[21]，這為后期能夠大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)VZV gE亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

A: Normal HF cells and cells were infected with VZV or HCMV AD169 respectively; normal Vero cells and cells were infected with HSV-1 or HSV-2 respectively. B: HF cells were infected with VZV, and each panel shows DAPI (left), Alexa Fluor488 labeled goat anti-mouse IgG (middle) fluorescence signals, as well as a merge (right). C: HCMV-infected HF cells, HSV-1 infected Vero cells and HSV-2 infected Vero cells were stained with DAPI (upper) or Alexa Fluor488 labeled goat anti-mouse IgG (lower) respectively. Scale bar is 50 μm.