張維杰 汪 楊 王國(guó)強(qiáng) 金春杰

（1 吉林省人民醫(yī)院感染科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院感染科，吉林 長(zhǎng)春 130021；3 吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021）

肺炎克雷伯菌屬于一種常見(jiàn)的感染病菌，其屬于革蘭陰性桿菌，容易在患者的呼吸道與腸道進(jìn)行定植[1]，從而導(dǎo)致患者血液、呼吸道、泌尿道、手術(shù)切口、顱內(nèi)等多部分感染[2]。屬于院內(nèi)感染的常見(jiàn)病菌，同時(shí)也是一種耐藥菌。在醫(yī)院的臨床標(biāo)本檢測(cè)當(dāng)中，分離到了很多泛耐藥性的腸桿菌科細(xì)菌，如肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌等。而這些耐藥菌株會(huì)產(chǎn)生超廣譜β內(nèi)酰胺酶以及青霉烯酶，并且還容易導(dǎo)致抗生素的活性下降[3]，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥性，在臨床治療中藥物療效受到顯著影響，特別是對(duì)于KPC型碳青霉烯酶而言，甚至可以通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)傳播，其傳播速度非?？?，并且具有廣泛的耐藥譜，病菌流行較快。本次研究特對(duì)本院KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌進(jìn)行檢測(cè)，分析其具體檢測(cè)方法以及耐藥性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本次研究中菌株來(lái)源為本院分離的耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，菌株選取量為50例，研究時(shí)間從2016年1月1日至2018年9月1日。菌株鑒定方法采用藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)儀器為法國(guó)梅里埃生物技術(shù)公司生產(chǎn)的全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)。PCR檢測(cè)采用德國(guó)Eppendorf公司的PCR儀，美國(guó)Syngene公司生產(chǎn)的凝膠成像系統(tǒng)。德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)的高速離心機(jī)?？咕幬镌嚰堄蒓xoid公司提供。

1.2 方法：①分離菌株：在本院各科室收集不同類(lèi)型標(biāo)本進(jìn)程培養(yǎng)，在培養(yǎng)完成后采用氧化酶試驗(yàn)、革蘭染色實(shí)驗(yàn)操作，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇革蘭陰性菌卡片，采用全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定，將霍氏腸桿菌與嗜麥芽窄食單胞菌作為質(zhì)控菌株。②藥敏試驗(yàn)：對(duì)50株耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌采用藥敏試驗(yàn)，采用K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)阿米卡星、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢替坦、復(fù)方磺胺甲惡唑、哌拉西林他唑巴坦、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、氨曲南等藥物進(jìn)行耐藥性分析。③Hodge試驗(yàn)：采用K-B法進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗(yàn)，并且對(duì)患者接種大腸埃希菌ATCC25922，通過(guò)生理鹽水的方式制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)的菌懸液M-H平板，后放置5 min進(jìn)行干燥，干燥完成后放置在厄他培南紙片上，厄他培南劑量為10 μg，使接種在血平板上生長(zhǎng)一夜，取紙片邊緣向外畫(huà)直線的10 μL接種環(huán)，劃線長(zhǎng)度在25 mm以上，采用陰性陽(yáng)性對(duì)照的方式，觀察抑菌環(huán)與測(cè)菌株交叉處是否存在增強(qiáng)生長(zhǎng)的情況。④PCR檢測(cè)：制備模板DNA，采用煮沸裂解法進(jìn)行制備，將KPC陽(yáng)性菌株作為對(duì)照，將ATCC700603作為陰性對(duì)照。

1.3 觀察標(biāo)準(zhǔn)：①KPC陽(yáng)性菌株陽(yáng)性率（PCR檢測(cè)、Hodge試驗(yàn)）、②不同藥物耐藥性分析（阿米卡星、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢替坦、復(fù)方磺胺甲惡唑、哌拉西林他唑巴坦、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、氨曲南）。

2 結(jié)果

2.1 KPC陽(yáng)性菌株陽(yáng)性率：從50例耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株的檢測(cè)情況上看，在Hodge試驗(yàn)中，其中KPC陽(yáng)性菌株41例，陽(yáng)性率為82.0%；在PCR檢測(cè)中，檢測(cè)出KPC陽(yáng)性菌株43例，陽(yáng)性率為86.0%。

2.2 不同藥物耐藥性分析：從藥敏試驗(yàn)上看，其中對(duì)于頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢噻肟等藥物耐藥率為100%，對(duì)于頭孢他啶的耐藥性為96.0%，對(duì)于頭孢吡肟的耐藥率為90.0%，對(duì)于頭孢替坦的耐藥率為84.0%、對(duì)于復(fù)方磺胺甲惡唑的耐藥率為90.0%，對(duì)于哌拉西林他唑巴坦的耐藥率為72.0%，對(duì)于左氧氟沙星的耐藥率為64.0%，環(huán)丙沙星的耐藥率為64.0%，對(duì)于阿莫西林的耐藥率為88.0%，對(duì)于氨曲南的耐藥率為96.0%，對(duì)于對(duì)于阿米卡星藥物耐藥率最低，為40.0%。見(jiàn)表1。

表1 50例菌株對(duì)于不同藥物耐藥性分析

3 討論

KPC酶首次發(fā)現(xiàn)是在美國(guó)的1例肺炎克雷伯菌當(dāng)中分離到的，這種病菌對(duì)于美羅培南藥物具有較高的耐藥性，屬于碳青霉烯Ambler分類(lèi)當(dāng)中的一類(lèi)[4]，這種酶的結(jié)構(gòu)特征比較類(lèi)似于碳?xì)涿瓜┟?，根?jù)臨床研究表明，KPC酶幾乎可以對(duì)所有的β內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物進(jìn)行水解，但是對(duì)于頭霉素而言不能水解[5]。

肺炎克雷伯菌屬于一種常見(jiàn)的感染病菌，其屬于革蘭陰性桿菌，容易在患者的呼吸道與腸道進(jìn)行定植，從而導(dǎo)致患者血液、呼吸道、泌尿道、手術(shù)切口、顱內(nèi)等多部分感染。碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物目前是抗菌譜最廣[6]，并且抗菌活性最強(qiáng)的一種抗菌藥物，因此在臨床上將碳青霉烯酶作為多耐藥菌感染疾病的主要治療抗菌藥物，在本次研究當(dāng)中，頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、復(fù)方磺胺甲惡唑、氨曲南等藥物的耐藥率均在90%～100%，而阿米卡星藥物的耐藥率為40%，左氧氟沙星與環(huán)丙沙星的耐藥率均為64.0%，符合臨床大部分報(bào)道。另外，隨著碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，因此這類(lèi)抗菌藥物的耐藥藥物檢出率也越來(lái)越高，在臨床治療中，肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的藥理機(jī)制主要為Ampc酶，而KPC酶屬于Bush類(lèi)，克拉維酸對(duì)于這種酶均有顯著的活性抑制作用，從目前的KPC酶來(lái)看，已經(jīng)檢測(cè)出的具有多種類(lèi)型，在本次實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，沒(méi)有采用不同類(lèi)型的KPC酶作為引物，對(duì)于其耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究[7]。

碳青霉烯酶的基因主要在可轉(zhuǎn)移性的質(zhì)粒上，并且可以利用多種基因元件作為傳播的介導(dǎo)，因此多種耐藥菌株的傳播性比較強(qiáng)，對(duì)于臨床治療當(dāng)中，為了縮短患者的治療周期，同時(shí)避免濫用抗菌藥物的情況發(fā)生，需要對(duì)碳青霉烯酶的菌株進(jìn)行耐藥性分析[8]。為了有效的避免耐藥菌在醫(yī)院內(nèi)部傳播與流行，需要采用嚴(yán)格的控制感染方案[9]。

抗菌藥物的運(yùn)用會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)，而這些耐藥菌株會(huì)產(chǎn)生超廣譜β內(nèi)酰胺酶以及青霉烯酶，并且還容易導(dǎo)致抗生素的活性下降，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥性，影響臨床治療效果[10]。從國(guó)內(nèi)抗菌藥物運(yùn)用情況上分析，各種抗菌藥物的濫用導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)，因此需要預(yù)防更多的耐藥菌株出現(xiàn)，需要采用科學(xué)合理的藥物治療方案。同時(shí)還需要擴(kuò)大藥敏試驗(yàn)的藥物種類(lèi)，避免出現(xiàn)無(wú)藥可用的情況。從目前的情況來(lái)看，超廣譜抗菌藥物的耐藥菌越來(lái)越多，導(dǎo)致抗菌藥物的濫用[11]，進(jìn)而導(dǎo)致碳青霉烯菌在世界范圍內(nèi)流行。從肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的種類(lèi)來(lái)看，其中A類(lèi):絲氨酸碳青霉烯酶主要包含了（IMI酶GES酶）KPC酶、SME酶，而B(niǎo)類(lèi)：金屬β-內(nèi)酰胺酶則主要包括了NDM、VIM、IMP、GIM、SPM，而這種類(lèi)型的酶一般存在非發(fā)酵菌當(dāng)中，在我國(guó)腸桿菌科細(xì)菌種B類(lèi)少見(jiàn)（腸桿菌科比較罕見(jiàn)）。KPC酶最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，并且在美國(guó)較為多見(jiàn)，在本世紀(jì)初，我國(guó)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院在臨床上分離出了KPC酶的肺炎克雷伯菌，同時(shí)也是我國(guó)首次分離出KPC酶，由此可見(jiàn)，KPC酶肺炎克雷伯菌再也不是地區(qū)性的病菌傳播，而是世界性的感染病菌，這種病菌發(fā)生的主要因素是由青霉烯類(lèi)抗菌的濫用引起的耐藥突變。

在本次研究當(dāng)中，從50例耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株的檢測(cè)情況上看，在Hodge試驗(yàn)中，其中KPC陽(yáng)性菌株41例，陽(yáng)性率為82.0%；在PCR檢測(cè)中，檢測(cè)出KPC陽(yáng)性菌株43例，陽(yáng)性率為86.0%。

從藥敏試驗(yàn)上看，其中對(duì)于頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢噻肟等藥物耐藥率為100%，對(duì)于頭孢他啶的耐藥性為96.0%，對(duì)于頭孢吡肟的耐藥率為90.0%，對(duì)于頭孢替坦的耐藥率為84.0%、對(duì)于復(fù)方磺胺甲惡唑的耐藥率為90.0%，對(duì)于哌拉西林他唑巴坦的耐藥率為72.0%，對(duì)于左氧氟沙星的耐藥率為64.0%，環(huán)丙沙星的耐藥率為64.0%，對(duì)于阿莫西林的耐藥率為88.0%，對(duì)于氨曲南的耐藥率為96.0%，對(duì)于對(duì)于阿米卡星藥物耐藥率最低為40.0%。臨床治療耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的藥物可選擇的不多：常用的是以替加環(huán)素、多粘菌素為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療，備選藥物有：碳青霉烯、磷霉素、氨基糖苷、氨曲南、環(huán)丙沙星等少數(shù)藥物，即將上市的頭孢他啶/阿維巴坦對(duì)產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌臨床觀察療效較好，值得期待。

綜上所述，在近3年2家相鄰醫(yī)院50例耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)了KPC陽(yáng)性菌株，并且該病菌對(duì)于不同藥物的臨床耐藥性不同，對(duì)于頭孢類(lèi)藥物耐藥率較高，具體耐藥性還需要進(jìn)一步檢測(cè)。在臨床治療中，醫(yī)師需要慎重選擇抗生素治療，并且加強(qiáng)臨床抗菌藥物監(jiān)控，避免抗菌藥物濫用。