王 麗，段翠密，原芳芳，王 燕，郭希民，郭紅延

骨折或者骨缺損愈合需要較漫長的鈣化和改建過程，給患者帶來巨大痛苦，降低患者生活質(zhì)量，加速骨折愈合成為中外學者關(guān)注的焦點問題。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)來源的外泌體是一種納米級囊泡樣小體，直徑為40～100 nm，并含有大量的細胞因子和生長因子，可通過轉(zhuǎn)運特異性蛋白、脂質(zhì)、mRNA和miRNA等生物活性物質(zhì)，參與細胞及內(nèi)環(huán)境之間的物質(zhì)運輸和信號傳遞[1]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的外泌體可以促進成骨細胞的增殖與分化[2]，然而骨髓MSC的提取過程復(fù)雜，具有侵入性，感染概率高，不利于外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)。因此，從產(chǎn)后廢棄組織中提取干細胞成為首選[3]，hucMSCs來源豐富、免疫原性低、無倫理道德爭議、倍增時間短、擴增能力強，便于進行商品化生產(chǎn)。

在對hucMSC-exo的研究中發(fā)現(xiàn)其具備hucMSC的大部分優(yōu)勢且無致瘤[4]。目前，還沒有關(guān)于hucMSC-Exos對成骨細胞生物學行為影響的報道。因此，本研究從細胞條件培養(yǎng)液中提取并鑒定hucMSC-exo，通過體外細胞實驗觀察hucMSC-exo對mOPCs增殖與分化的影響，以期為未來hucMSC-exo在骨修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 胎牛血清、α-MEM(Gibco，美國)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(Thermo Fisher，美國)；地塞米松、維生素C、β-磷酸甘油鈉、油紅干粉(Sigma，美國)；成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(Cyagen，中國)；堿性磷酸酶染色試劑盒(上海邁基，中國)；CCK-8(同仁，日本)；Anti-CD9抗體(Millipore，美國)；Anti-CD63抗體(Affinity Biosciences，美國)；超速離心機(Beckman Optima TM L-100XP，美國)；電泳儀(Bio-Rad，美國)；倒置顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 實驗動物 健康新生24 h內(nèi)C57BL/6乳鼠及3周齡C57BL/6小鼠(SPF級)，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于解放軍軍事醫(yī)學科學院SPF動物實驗室。

1.3 方法

1.3.1 mOPCs的分離培養(yǎng) 按照貼壁法分離培養(yǎng)原代mOPCs[5]。將健康新生24 h內(nèi)的C57BL/6乳鼠浸泡于75%乙醇中，進行皮膚消毒，5 min后取出，脫頸處死，無菌條件下取出小鼠顱骨，去除其周圍組織并盡可能地剪碎，加入0.25%的胰酶及0.1%的膠原酶消化20 min后，用等量的完全培養(yǎng)液終止消化，1000 r/min，離心5 min后，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液吹散，將碎骨片鋪于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5～7 d，于第3天更換培養(yǎng)液，之后隔天更換培養(yǎng)液，全程避免骨片移位，待細胞融合達到70%～80%時傳代，并進行傳代穩(wěn)定性觀察。

1.3.2 hucMSCs的體外分離培養(yǎng)與鑒定 人臍帶來源于解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，產(chǎn)婦及家屬知情同意。按照Koh等[6]方法提取hucMSC，即無菌留取健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)臍帶，生理鹽水洗凈，用青霉素、鏈霉素雙抗浸泡，去包膜、臍動脈、臍靜脈，將華通氏膠剪碎，貼壁培養(yǎng)，待大部分細胞爬出，瓶底長滿細胞，進行換液、傳代，觀察細胞生長狀況。取第3代hucMSCs以1×105細胞/孔接種于含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液的6孔板中，待細胞融合至60%時，分別進行成骨、成脂及成軟骨誘導(dǎo)。(1)hucMSCs的體外成骨分化及鑒定：細胞融合至60%時，改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含有10%FBS，0.1 μM地塞米松，10 mMβ-甘油磷酸酯和50 μg/ml抗壞血酸的α-MEM培養(yǎng)液)，間隔3 d換液一次。14 d后，將細胞固定，馮·科薩染色觀察。(2)hucMSCs的體外成脂分化及鑒定：細胞融合至60%時，改用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含有1 μM地塞米松，0.5 mM 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤，100 μM吲哚美辛和10 μM胰島素的α-MEM培養(yǎng)液)，14 d后，進行油紅O染色評估。(3)hucMSCs的體外成軟骨分化及鑒定：取處于對數(shù)生長期的4到9代hucMSCs，傳代后取2×105個細胞在15 ml離心管內(nèi)以800 r/min離心5 min，細胞會在離心管底部形成小球，輕柔地吸掉上清液，換用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(以α-MEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加6.25 μg/ml胰島素、6.25 μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、10 ng/ml轉(zhuǎn)化生長因子β1、0.1 μmol/L地塞米松、50 μg/ml維生素C、5%胎牛血清)進行培養(yǎng)，間隔3 d換液1次，21 d后將細胞固定，石蠟包埋切片后進行HE染色以及免疫組化法測定軟骨組織特異性Ⅱ型膠原。

1.3.3 hucMSC-exo的分離與鑒定 按照Zhang等[7]所述方法提取外泌體，即取3～8代融合至80%的hucMSCs，以不含血清的α-MEM培養(yǎng)液饑餓處理，48 h后收集上清，1000 r/min離心10 min，去除細胞和細胞碎片，收集上清并通過0.22 μm的濾膜過濾以去除大于220 nm的囊泡顆粒。于4 ℃環(huán)境下，34 288 r/min離心80 min收集外泌體并儲存于-80℃，備用。使用BCA蛋白檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific)測定外泌體蛋白含量。通過透射電子顯微鏡(TEM，HITACHI，H-7650)觀察外泌體的形態(tài)。RIPA裂解液裂解hucMSC-exo通過Western blot鑒定外泌體特征性標志物CD9和CD63。

1.3.4 mOPCs增殖實驗 細胞分組 對照組為mOPCs培養(yǎng)于5%FBS的α-MEM培養(yǎng)液；5 μg/ml hucMSC-exo實驗組為mOPCs培養(yǎng)于含有5 μg/ml的外泌體、5%FBS的α-MEM培養(yǎng)液；10 μg/ml hucMSC-exo實驗組為mOPCs培養(yǎng)于含有10 μg/ml的外泌體、5%FBS的α-MEM培養(yǎng)液。將P2代mOPCs以2×103個細胞/孔的密度接種于96孔板中，每組4個復(fù)孔，加入各組相對應(yīng)的培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)，間隔2 d換液，分別于1、3、5、7 d經(jīng)CCK-8試劑盒測定450 nm處吸光度值，并繪制生長曲線。

1.3.5 堿性磷酸酶活性測定 將mOPCs以1×104個細胞/孔接種于24孔板，分組同上，每組3個復(fù)孔，加入對應(yīng)培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)7 d，棄上清，PBS洗滌3次，按照堿性磷酸酶檢測試劑盒說明書進行染色，利用IMAGE J軟件對染色結(jié)果進行半定量分析。

1.3.6 茜素紅染色 將mOPCs以1×105個細胞/孔接種于12孔板，分組同上，每組3個復(fù)孔，加入各組相對應(yīng)的培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)21 d，各組細胞用4%多聚甲醛液固定10 min后，PBS洗滌3次，茜素紅染色30 min，蒸餾水清洗，觀察拍照。加入10%氯化十六烷基吡啶溶解1 h，吸取懸液，測562 nm處A值。

2 結(jié) 果

2.1 mOPCs的分離培養(yǎng) 原代培養(yǎng)mOPCs，骨片貼壁48 h后有大量細胞從骨片爬出，體積較小，胞體飽滿，突起較短，細胞增殖較快，細胞匯合后傳代培養(yǎng)(圖1A)。傳代后細胞以梭形為主，細胞呈半透明狀，輪廓清晰，旋渦狀生長(圖1B和圖1C)。

圖1 mOPCs的分離培養(yǎng)(100×)

2.2 hucMSCs體外分離培養(yǎng)和鑒定 原代hucMSCs體外培養(yǎng)7 d，可見細胞貼壁呈梭形，半透明狀，輪廓清晰，部分聚集成簇，呈旋渦狀生長(圖2A)。多向分化結(jié)果顯示，hucMSCs體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d時，馮·科薩染色顯示礦化結(jié)節(jié)形成(圖2B)。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d后，油紅O染色見胞漿中出現(xiàn)圓形或橢圓形紅色串珠狀脂滴(圖2C)。成軟骨分化21 d后，HE染色可見組織團塊內(nèi)細胞分布較均勻，細胞外基質(zhì)較為豐富(圖2D)，阿爾辛藍染色可見淡藍色的軟骨基質(zhì)成分(圖2E)，免疫組化染色顯示細胞外基質(zhì)中可見彌漫分布的Ⅱ型膠原(圖2F)。

圖2 hucMSCs分離培養(yǎng)與鑒定

A. hucMSCs原代培養(yǎng)；B. 馮·科薩染色；C. 油紅O染色；D. HE染色；E. 阿爾辛藍染色；F. Ⅱ型膠原染色

2.3 hucMSC-exo的分離與鑒定結(jié)果 透射電鏡下可見外泌體呈橢圓形、圓形，膜結(jié)構(gòu)完整，對3個樣品的多個視野進行粒徑分析顯示，粒徑大小為(80.0±32.5)nm(圖3A)。Western blot的分析結(jié)果顯示外泌體的特征性標志物CD9和CD63陽性表達(圖3B)，符合文獻[8]報道的外泌體的生物學特性和鑒定標準，說明成功分離獲得了hucMSC-exo。

圖3 hucMSCs-exo的鑒定

2.4 hucMSC-exo促進mOPCs增殖 CCK8結(jié)果顯示實驗組和對照組相比，在3、5、7 d時，添加hucMSC-exo(5 μg/ml，10 μg/ml)的實驗組其mOPCs的增殖數(shù)量明顯增加，且隨著外泌體濃度的增高，增殖越明顯，呈現(xiàn)劑量依賴性(圖4)。

2.5 hucMSC-exo促進mOPCs的成骨分化 堿性磷酸酶活性染色結(jié)果顯示，mOPCs培養(yǎng)7 d后，鏡下觀察可見添加hucMSC-exo實驗組會有大量棕色硫化鈷顆粒沉積于胞質(zhì)中(圖5)，堿性磷酸酶活性顯著高于空白對照組，且酶的此種活性效應(yīng)隨著外泌體濃度的增加而增大，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。IMAGE J軟件半定量分析結(jié)果顯示，5 μg/ml和10 μg/ml hucMSC-exo實驗組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表1)。

圖4 hucMSC-exo對mOPCs增殖的影響

圖5 hucMSC-exo刺激mOPCs后ALP染色(400×)

組別nALP半定量分析結(jié)果Control1224.61±1.925 μg/ml hucMSC-exo1252.35±3.97①10 μg/ml hucMSC-exo12108.32±3.69①②P0.05

注：與Control組相比，①P<0.05；與5 μg/ml hucMSC-exo組相比，②P<0.05

茜素紅染色結(jié)果顯示(圖6)，mOPCs培養(yǎng)21 d后，鏡下觀察可見添加hucMSC-exo實驗組能夠分泌出更多的礦化基質(zhì)，有大量的鈣化結(jié)節(jié)形成，空白對照組則形成較少，茜素紅染色定量結(jié)果顯示空白對照組A562為0.324，5 μg/ml和10 μg/ml的hucMSC-exo實驗組A562分別為1.352和1.87，均高于對照組，且此種鈣化結(jié)節(jié)的形成隨著外泌體濃度的增加而增大，亦表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

圖6 hucMSC-exo刺激mOPCs后茜素紅染色結(jié)果(100×)

3 討 論

據(jù)報道，MSC療法可促進骨再生和骨折愈合[9, 10]。以往的研究證明，MSC療法在損傷修復(fù)過程中可以觸發(fā)細胞、細胞外基質(zhì)以及信號分子之間的相互作用。但是，迄今為止尚未完全闡明這種作用的發(fā)生機制。在眾多潛在的分子機制中，MSC釋放的外泌體被認為是至關(guān)重要的，并引起了越來越多的關(guān)注[11, 12]。Narayanan等[13]發(fā)現(xiàn)人骨髓基質(zhì)細胞來源的外泌體可觸發(fā)未分化的人骨髓基質(zhì)細胞成骨分化，Qin等[14]經(jīng)體內(nèi)體外實驗研究證明BMSC衍生的外泌體可以通過增強成骨基因的表達來調(diào)控成骨細胞分化。與眾多的MSC相比，hucMSCs來源于產(chǎn)后廢棄組織，來源廣泛，無倫理道德爭議，分離方法簡單、產(chǎn)量高、增殖快，易于大規(guī)模生產(chǎn)，Todeschi等[15]研究發(fā)現(xiàn)hucMSCs的骨修復(fù)作用與干細胞通過旁分泌作用調(diào)節(jié)靶細胞功能有關(guān)，但他們無法證實外源性干細胞與內(nèi)源性祖細胞之間是否發(fā)生了細胞間串擾。我們目前的研究提供了第一個有力的證據(jù)，表明外源性干細胞可以通過產(chǎn)生外泌體與mOPCs進行對話，并對其生物學行為產(chǎn)生影響。

本實驗通過低溫超速離心法獲得較純的外泌體，電鏡下呈杯托狀，大小多集中在90 nm處，并且能表達CD9和CD63標志性表面蛋白，符合外泌體的生物學特性和鑒定標準[16]。將hucMSC-exo與mOPCs復(fù)合培養(yǎng)，進行細胞增殖實驗，結(jié)果顯示hucMSC-exo可以明顯促進mOPCs的增殖，且此種增殖效應(yīng)隨著時間和劑量的增加而增加，表現(xiàn)出顯著的時間依賴性和劑量依賴性。堿性磷酸酶活性水平是mOPCs早期成骨分化的重要評價指標[17]，在hucMSC-exo刺激下培養(yǎng)7 d，mOPCs表現(xiàn)出更高的堿性磷酸酶活性。分化成熟的mOPCs會進一步產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)，是mOPCs成熟期成骨分化的重要指標之一，在hucMSC-exo刺激下mOPCs培養(yǎng)21 d，可見更多的鈣結(jié)節(jié)形成，且隨著劑量增大而增加，亦表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

綜上所述，本實驗從體外驗證了hucMSC-exo可以促進mOPCs的增殖以及提高其成骨分化能力，提示在未來研究中可考慮直接使用hucMSC-exo進行骨損傷治療，以期取代間充質(zhì)干細胞，實現(xiàn)“無細胞再生醫(yī)學”[18]，但目前，對干細胞源外泌體的研究仍處于臨床前期，有諸多問題阻礙其臨床應(yīng)用，有待深入闡明，例如，如何大量富集、純化、標記外泌體，如何根據(jù)外泌體半衰期制定合適的給藥途徑及給藥頻次，如何提高治療靶向性等[19, 20]。此外，hucMSC-exo中含有miRNA、mRNA、IncRNA及蛋白質(zhì)等多種生物活性分子，其作用很可能與這些生物活性分子有關(guān)，但具體由哪一種或者由哪幾種活性物質(zhì)，以何種方式起作用尚不清楚，在未來研究中還需進一步闡明。