李 維，張 婷，王 飛，詹愛(ài)軍，王 超，陳 勇

（深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，廣東 深圳 518010）

禽流感（Avian influenza，AI）是由A 型流感病毒（AIV）引起的病毒性烈性傳染病，是目前危害世界及我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的最重要的疫病之一［1-2］. H9 亞型病毒為低致病性毒株，致死率雖然較低，但感染會(huì)引起禽類的呼吸道癥狀以及產(chǎn)蛋率的下降，是一種嚴(yán)重危害禽類養(yǎng)殖行業(yè)生產(chǎn)的病原微生物［3-5］.及時(shí)準(zhǔn)確地對(duì)H9亞型禽流感病毒感染進(jìn)行診斷，是針對(duì)性診治從而降低經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵環(huán)節(jié).

目前，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展禽流感的檢測(cè)方法較多，主要分為傳統(tǒng)方法與分子生物學(xué)方法，傳統(tǒng)方法多為病毒分離培養(yǎng)和血清學(xué)診斷，其不足之處在于操作繁瑣且結(jié)果重復(fù)性不好［6-9］；分子生物學(xué)檢測(cè)，包括RTPCR 檢測(cè)法、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR（real time RT-PCR）檢測(cè)法、基因芯片檢測(cè)法等，分子生物學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用也非常迅速，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高，所需儀器設(shè)備昂貴，不易在基層獸醫(yī)部門(mén)推廣［10-11］.

本實(shí)驗(yàn)室以抗禽流感病毒核蛋白單克隆抗體為基礎(chǔ)，應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，研制了H9 亞型禽流感病毒的特異性膠體金層析檢測(cè)卡，為禽流感病毒的快速診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷的有效工具.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗體、抗原與血清

H9 亞型禽流感病毒HA 單克隆抗體，源自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病與預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；H9亞型AIV 的陽(yáng)性血清和陰性血清、禽流感病毒H9N2 抗原、H1N1 抗原、H3N2 抗原、NDV 抗原，IBDV 抗原，IBV 抗原、ILTV 抗原購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家動(dòng)物工程中心.

1.1.2 試劑耗材

牛血清白蛋白（BSA）、Tween-20，Tritonx-100、Polyvinylpyrrolidone（PVP-40）為sigma 公司產(chǎn)品；氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O），購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羊抗鼠二抗購(gòu)于長(zhǎng)沙博優(yōu)生物科技有限公司，ABGAM-0500；檸檬酸三鈉、疊氮鈉（NaN3）及一些常用化學(xué)試劑購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑公司；硝酸纖維膜（Nitrocellulose membrane）購(gòu)于waterman 和Schleicher&Schuell 公司；玻璃纖維膜（glass fibre）、吸水紙（absorbent paper）、支持板均購(gòu)于上海金標(biāo)生物科技有限公司.膠體金優(yōu)化試劑：膠體金免疫層析優(yōu)化劑套裝（SDS-L、SDS-F、L-30、L-90D），購(gòu)自深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司.

1.1.3 膠體金常用試劑

1%HAuCl4水溶液、檸檬酸三鈉水溶液、0.2 mol/L K2CO3、10% BSA、10% PVP-40、10% Tween-20、10% 疊氮鈉、玻璃器皿清潔液、金標(biāo)墊處理液、樣品墊處理液、抗原稀釋液、二抗稀釋液、0.2 mol/L PB（pH7.4）、5%二氯二鉀硅烷的氯仿溶液.

1.2 禽流感病毒膠體金檢測(cè)方法

1.2.1 膠體金的制備

取用新制超純水100 mL 置于圓底燒瓶?jī)?nèi)，上接冷凝管置于磁力加熱攪拌器上加熱至煮沸，煮沸后繼續(xù)加熱3 min.

之后準(zhǔn)確吸取2 mL 1%氯金酸水溶液，加入圓底燒瓶?jī)?nèi)，繼續(xù)加熱煮沸3 min 后，再準(zhǔn)確吸取1%檸檬酸三鈉水溶液3.2 mL，迅速加入圓底燒瓶中，開(kāi)啟攪拌，此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉溶液加入后很快變灰色，續(xù)而顏色繼續(xù)加深轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸轉(zhuǎn)為酒紅色，整個(gè)過(guò)程約2～3 min.待溶液變成穩(wěn)定的酒紅色后，繼續(xù)加熱煮沸15 min 后置于室溫下冷卻.

待膠體金懸液冷卻至室溫后，加入0.02%的疊氮鈉，經(jīng)一次性滅菌濾器過(guò)濾，置于潔凈玻璃瓶中4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 免疫膠體金的制備

1.2.2.1 膠體金標(biāo)記抗體的最適pH

由于不同的pH 環(huán)境會(huì)影響抗體與膠體金顆粒的結(jié)合，因此將膠體金懸液調(diào)節(jié)成不同的pH，通過(guò)加入過(guò)量的待標(biāo)記H9 亞型禽流感單克隆抗體，考查標(biāo)記抗體的活性和特異性.實(shí)驗(yàn)將膠體金溶液pH 分別調(diào)整為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，加入濃度為50μg/mL 的禽流感病毒單克隆抗體，混勻靜置15 min 后觀察反應(yīng)體系.

1.2.2.3 膠體金與待標(biāo)記抗體用量比例的確定

本研究采用經(jīng)典NaCl 滴定法確定最佳標(biāo)記量，將待標(biāo)記的抗體分別稀釋為10、15、20 、25、30、35、40 μg/mL，各取5 μL，順序加入一系列裝有0.5 mL 膠體金懸液的試管中，另設(shè)一不加抗體的對(duì)照管.混勻靜置15 min.于上述管中分別加入0.1 mL 10% NaCl 溶液，混勻，靜置20 min，觀察結(jié)果.

1.2.2.4 抗體的膠體金標(biāo)記

按照得到的最佳抗體標(biāo)記條件標(biāo)記抗體，經(jīng)離心后棄上清，沉淀加入金標(biāo)復(fù)溶液復(fù)溶后，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 金標(biāo)檢測(cè)卡的制備

1.2.3.1 金標(biāo)膜的制備

膠體金標(biāo)記物制備后，用BioDot 的XYZ3050 噴金系統(tǒng)將其按照2.0、2.5、3.0 μL/cm 的噴量均勻噴涂在金標(biāo)結(jié)合墊上后，將其移入真空干燥箱內(nèi)，真空干燥2 h，加入干燥劑，用鋁箔袋密封保存于4 ℃冰箱中.

1.2.3.2 硝酸纖維素反應(yīng)膜的制備

采用抗原、二抗稀釋液，將羊抗鼠二抗配分別配制成2、1.5、1、0.5 mg/mL 溶液，用BioDot 的XYZ3050劃膜系統(tǒng)將其包被至硝酸纖維素膜（NC 膜）的質(zhì)控線（C 線）位置；未用于標(biāo)金的另一株H9 亞型禽流感病毒包被抗體分別配制濃度為2.4、2.1、1.8、1.5 mg/mL 的溶液，用BioDot XYZ3050 劃膜系統(tǒng)將其包被至硝酸纖維素膜的檢測(cè)線（T 線）位置，于相對(duì)濕度為30%以下的37 ℃干燥車間干燥48 h 后待用，得到具有檢測(cè)線和質(zhì)控線的包被膜.

1.2.3.3 檢測(cè)卡的組裝

將NC 膜平展貼于粘性底板的中央，膠金墊平貼于NC 膜T 線的下方，重疊NC 膜0.3 cm，樣品墊再平貼于膠金墊上，重疊膠金墊一部分.將吸水紙平放于NC 膜C 線的一端，重疊NC 膜0.3 cm.并于CM4000切條機(jī)上，將其切成3 mm 寬的檢測(cè)試條，用鋁箔袋密封保存于4 ℃冰箱中.

1.2.3.4 預(yù)期反應(yīng)狀況及結(jié)果

如果被檢樣品中含有禽流感病毒抗原，抗原首先在金標(biāo)墊上與金標(biāo)單抗結(jié)合形成“禽流感病毒-金標(biāo)單抗”復(fù)合物，該復(fù)合物繼續(xù)在毛細(xì)作用下向上泳動(dòng)，與固定在檢測(cè)線上的禽流感病毒多抗結(jié)合形成“禽流感病毒多抗-禽流感病毒-金標(biāo)禽流感病毒單抗”復(fù)合物的富集體，從而呈現(xiàn)紅色；沒(méi)有結(jié)合抗原的金標(biāo)單抗繼續(xù)向前泳動(dòng)，與固定在陰性對(duì)照線上的羊抗鼠二抗形成“羊抗鼠二抗-金標(biāo)抗禽流感病毒單抗”復(fù)合物富集體（質(zhì)控線），從而呈現(xiàn)紅色.檢測(cè)線和質(zhì)控線同時(shí)顯色的為陽(yáng)性反應(yīng)，只在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶為陰性反應(yīng).質(zhì)控線內(nèi)未出現(xiàn)紅色條帶，表明檢測(cè)結(jié)果無(wú)效.

1.3 禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡的性能測(cè)定試驗(yàn)

1.3.1 H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡靈敏性評(píng)估試驗(yàn)

以H9N2 亞型禽流感病毒試驗(yàn)抗原作為待測(cè)樣品來(lái)測(cè)定的檢測(cè)H9 亞型禽流感病毒檢測(cè)卡的靈敏度.將64 HA unit 的禽流感病毒H9N2 亞型AI 試驗(yàn)抗原用pH 為7.4 的0.02 M PBS 緩沖液進(jìn)行2 倍梯度稀釋，使其終濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016 HA unit，并設(shè)置空白樣，分別置于H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡上進(jìn)行檢測(cè).檢測(cè)步驟：檢測(cè)前先將待檢測(cè)樣品恢復(fù)至室溫（25℃），用精確移液器取待檢測(cè)樣品65 μL 垂直緩慢滴入H9 亞型禽流感病毒檢測(cè)卡的加樣端，5 min 后判讀結(jié)果.

1.3.2 禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡特異性評(píng)估試驗(yàn)

將H9 亞型禽流感病毒亞型和其他常見(jiàn)呼吸道病毒，包括家禽的呼吸道病毒（新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）），人呼吸道病毒（副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、冠狀病毒）等相同癥候群病毒，用pH 為7.4 的0.02 M PBS 緩沖液配制為較高的濃度，分別用精確移液器取65 μL 垂直緩慢滴入禽流感病毒檢測(cè)卡的加樣端，5 min 時(shí)判讀結(jié)果.

1.3.3 禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡小規(guī)模田間試驗(yàn)

采集田間試驗(yàn)樣品，包括家禽棉拭子樣品179 份，采集醫(yī)院臨床樣品21 份，對(duì)樣品同時(shí)進(jìn)行禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡的檢測(cè)和熒光RT-PCR 檢測(cè)，確定所建立方法的實(shí)用性.

2 結(jié)果

2.1 免疫膠體金的制備

2.1.1 膠體金標(biāo)記抗體的最適pH

將膠體金調(diào)成不同的pH 值，加入過(guò)量的待標(biāo)記的H9 亞型禽流感單克隆抗體（50 μg/mL），考察標(biāo)記抗體的活性和特異性.結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 H9 亞型最適抗體標(biāo)記pH 值的確定

由表1 可知，膠體金標(biāo)記H9 亞型禽流感抗體的最佳pH 值為9.5 時(shí)，其活性、特異性較好.

2.1.2 膠體金與待標(biāo)記抗體用量比例的確定

采用經(jīng)典NaCl 滴定法確定最佳標(biāo)記量，將待標(biāo)記的抗體逐級(jí)稀釋，各取5 μL，順序加入一系列裝有0.5 mL 膠體金的試管中，另設(shè)一個(gè)不加抗體的對(duì)照管.混勻，15 min 后，再于上述管中分別加入0.1 mL 10% NaCl 溶液，混勻，靜置20 min，結(jié)果見(jiàn)圖1 和表2，可以看出，抗體加入量少于25 μg 的，體系難以維持良好的穩(wěn)定性.因此膠體金標(biāo)記H9 亞型禽流感抗體最適蛋白標(biāo)記量為 25 μg/mL.

圖1 膠體金標(biāo)記抗體最適量的確定

表2 膠體金標(biāo)記H9 亞型禽流感抗體最適量的確定

2.1.3 抗體的膠體金標(biāo)記

取25 mL 膠體金于50 mL 離心管中，加入0.2 M K2CO3調(diào)節(jié)PH 值至9.5，充分混勻.取H9 亞型禽流感抗體625 μg 用0.01 M pH 7.4 PBS 稀釋后加入50 mL 離心管中，混勻，靜置30 min.加入2.5 mL 10% BSA溶液于50 mL 離心管中，混勻，靜置30 min .離心（4 ℃，8 500 g，30 min）后去上清，加入2.5 mL 膠體金標(biāo)記物稀釋緩沖液. 4 ℃保存?zhèn)溆?

2.2 金標(biāo)復(fù)溶物噴量與禽流感病毒抗體、羊抗鼠二抗稀釋倍數(shù)的確定

金標(biāo)復(fù)溶物通過(guò)BioDot 的XYZ3050 噴金系統(tǒng)吸附于玻璃纖維，在其它條件不變的情況下，將制作成的檢測(cè)卡相對(duì)于一系列稀釋的禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行方陣試驗(yàn).

表3 檢測(cè)線包被濃度和噴量的確定

由表3 可知，H9 亞型禽流感病毒包被抗體最佳工作濃度分別為2.1 mg/mL，噴量2.5 μL/cm 時(shí)得到的檢測(cè)線和質(zhì)控線條帶的清晰，靈敏度高，是較為合適的稀釋度.

不同濃度的禽流感病毒抗體、羊抗鼠二抗通過(guò)BioDot 的XYZ3050 劃膜系統(tǒng)吸附于硝酸纖維素膜上，在其它條件不變的情況下，將制作成的檢測(cè)卡相對(duì)于一系列稀釋的禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行方陣試驗(yàn)，經(jīng)方陣試驗(yàn)確定羊抗鼠二抗的最佳工作濃度為1 mg/mL，劃膜參數(shù)設(shè)定 1 μL/cm.

2.3 H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡靈敏性結(jié)果

將H9N2 標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行連續(xù)的倍比稀釋，采用所研制的H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果如表4 所示.

表4 H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡不同樣品濃度的檢測(cè)結(jié)果

從檢測(cè)結(jié)果中可以得出H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的H9N2 亞型流感病毒的靈敏度為0.5 HA unit.

圖2 H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡測(cè)試結(jié)果

2.4 H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡特異性結(jié)果

采用所研制的H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡，對(duì)引起人的呼吸道癥候群相關(guān)且與流感相近的病毒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果全部為陰性.對(duì)流感相近且引起家禽呼吸道癥候群的病毒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果也全部為陰性.檢測(cè)陰性基質(zhì)，包括正常人的鼻咽拭子、痰液、正常家禽的棉拭子、正常的家禽組織，檢測(cè)結(jié)果全部陰性.表明檢測(cè)卡不受基質(zhì)的影響，且檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng).其檢測(cè)結(jié)果如表5 所示.按照本方法制備的H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡能用于檢測(cè)H9 亞型禽流感病毒，與常見(jiàn)的呼吸道病毒IBV、呼腸孤病毒、NDV 之間沒(méi)有交叉反應(yīng).

表5 H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡交叉反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

2.5 禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡小規(guī)模田間試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)采集田間試驗(yàn)樣品200 份，全部同時(shí)進(jìn)行H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)卡的檢測(cè)和熒光RT-PCR檢測(cè)，兩者的檢測(cè)結(jié)果一致，表明檢測(cè)卡的實(shí)用性強(qiáng).

表6 H9 亞型禽流感病毒膠體金檢測(cè)法與熒光RT-PCR 檢測(cè)法對(duì)比結(jié)果

3 討論及結(jié)論

本課題研制的禽流感病毒膠體金快速檢測(cè)卡具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，利用本試條對(duì)副粘病毒新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原、傳染性喉氣管炎病毒、法氏囊病毒和傳染性支氣管炎病毒、H5 亞型禽流感病毒、H1亞型禽流感病毒等與H9 亞型禽流感病毒相近的家禽致病抗原進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果均為陰性；本試條檢測(cè)時(shí)間短，5 min 即可判讀結(jié)果，這與傳統(tǒng)的雞胚分離、血清學(xué)診斷技術(shù)以及PCR 等分子生物學(xué)診斷技術(shù)相比，不僅大大縮短檢測(cè)時(shí)間，還提高了檢測(cè)速度.檢測(cè)靈敏度高，可達(dá)到1 HA unit，可以滿足現(xiàn)場(chǎng)H9 亞型禽流感病毒的快速檢測(cè)需求，非常適宜在廣大基層單位推廣和應(yīng)用.