陳富海，林曉君，凃彥芳，劉博婷，余 璐，蔡鞏林，林錦銓，彭 凌

（韶關學院 英東生物與農(nóng)業(yè)學院，廣東 韶關 512005）

豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）可使豬患一種急性、熱性、敗血性傳染病，即豬丹毒.臨診癥狀急性型表現(xiàn)為敗血癥，亞急性表現(xiàn)為皮膚上出現(xiàn)疹塊.慢性病豬表現(xiàn)為心內膜炎和關節(jié)炎.各國研究人員對丹毒絲菌的研究已有一百多年，然而對其致病機制及毒力因子目前還未研究清楚［1］.從眾多研究可知丹毒絲菌屬各種菌株的毒力差別很大，有66%的紅斑丹毒絲菌會使動物致病，也有將近96%的扁桃體丹毒絲菌對動物無害.1882 年，Pasteur 首次從豬體內分離到此菌，對引起豬丹毒的病原進行精確描述是由Loffler 完成的，同時他還描述了豬感染該菌后出現(xiàn)的臨床癥狀，這是第一個描述這種有機體作為傳染性病原體引起豬的疾病.1883 年，Pasteur 和Thuillier 首次使用豬丹毒疫苗，此后，這種弱毒活疫苗和菌苗被長期用于控制豬和火雞的丹毒病癥［2］.豬丹毒絲菌在養(yǎng)殖業(yè)、食品衛(wèi)生安全以及人體健康等方面帶來了極大的威脅［3-4］.豬丹毒絲菌感染會引起熱性或急性人畜共患的傳染病，主要的傳染源是病豬以及各種帶菌動物（最主要是帶菌豬）［5］.滅活疫苗、弱毒疫苗是現(xiàn)有的預防手段，但仍存在缺點，如保護周期短、保護率低等［6］，而新一代的亞單位疫苗也存在免疫譜窄的弱點.現(xiàn)發(fā)現(xiàn)反向疫苗可以用細菌的毒力因子作研究的重要線索，同時探索毒力因子的種類并研究其功能，還將在研制安全高效的疫苗方面提供重要的理論基礎.因此對丹毒絲菌毒力因子的研究為了解各毒力因子相互關聯(lián)及其致病機制提供證據(jù)，并為有效減少豬丹毒對養(yǎng)殖業(yè)所造成的經(jīng)濟損失做出貢獻.

筆者以臨床分離的豬丹毒絲菌野生強毒株為材料，采用DNA 重組技術構建spaA 基因敲除載體，并利用該敲除載體結合同源重組技術敲除強毒株上的spaA 基因.然后比較強毒株和敲除株小鼠毒力的差異來揭示SpaA 在致病中的初步作用，并為進一步揭示SpaA 在致病中的作用機制奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

豬丹毒絲菌野生株SG7、大腸桿菌DH5α（由本實驗室保存）.

1.1.2 實驗試劑

氨芐青霉素、瓊脂糖、HindⅢ酶 、Pst Ⅰ酶、XbaⅠ酶、SmaⅠ酶、T4 DNA 連接酶、2×Pfu PCR Mix、SanPrep 柱式質粒小量抽提試劑盒、質粒載體pUC18、SanPrep DNA 抽提取試劑盒、SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒等均購買于生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.1.3 儀器

2720Thermal Cycler（美國Applied biosystem 公司）、JS-680 凝膠成像分析系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）、HZQ-F 恒溫振蕩培養(yǎng)箱、3K18 高速冷凍離心機（美國Sigma）、Ultrospec2000 紫外/可見分光光度計（美國Amersham Pharmacia Biotech）、DYY-6B 型穩(wěn)壓溫流電泳儀（北京市六一儀器廠）.

1.1.4 培養(yǎng)基

TSB 培養(yǎng)基：酵母粉0.5%，牛肉粉2.5%，胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.2%，Tween 80 0.05%；LB 培養(yǎng)基： 胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%.

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成

根據(jù)spaA 基因序列的上下游序列、Amp 抗性基因序列和載體pUC18 的多克隆位點，采用Primer Premier 5.0 軟件設計引物Up-s/Up-As、DOWN-s/DOWN-As 和Amp-s/Amp-As，分別根據(jù)spaA 基因設計和spaA 基因上下游區(qū)域設計內引物IN-1/IN-2 和外引物OUT-1/OUT-2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.引物信息見表1（斜體加粗部分為酶切位點）.

表1 引物序列和位置

1.2.2 目的片段的制備

以豬丹毒絲菌基因組DNA 作為模板，用表1 的引物分別擴增上游片段L、下游片段R 和Amp 抗性基因A. PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收后分別用Hind Ⅲ+Pst Ⅰ、Xba Ⅰ+Sma Ⅰ、Pst Ⅰ+Xba Ⅰ.雙酶切反應體系：目的片段或質粒載體（1～3μg），10×Tango Buffer（10μL），酶（2.5μL），用ddH2O 補足至總體積100μL. 37 ℃溫育3 h，65 ℃熱水浴15 min 使酶滅活，并回收酶切產(chǎn)物.

1.2.3 L、R 和A 片段的克隆

質粒載體經(jīng)Hind Ⅲ+Pst Ⅰ雙酶切后與經(jīng)同樣酶切處理的上游片段L 連接并轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進行擴培，經(jīng)質粒提取、雙酶切和測序鑒定篩選出陽性克隆子pUC18-L.pUC18-L 經(jīng)Pst Ⅰ和Xba Ⅰ酶切后與經(jīng)同樣酶切處理的Amp 抗性基因A 段相連，經(jīng)轉化、篩選和鑒定后獲得正確重組質粒pUC18-LA.pUC18-LA 經(jīng)過Xba Ⅰ和Sma Ⅰ雙酶切后與同樣酶切處理的下游片段R 相連，經(jīng)轉化、篩選和鑒定最終獲得敲除載體pUC18-LAR.

1.2.4 敲除載體pUC18-LAR 的鑒定

用SanPrep 柱 式 質 粒 小 量 抽 提 試 劑 盒 提 取 質 粒，用Hind Ⅲ+Pst Ⅰ、Hind Ⅲ+Xba Ⅰ、HindⅢ+SmaⅠ進行交叉雙酶切鑒定.雙酶切體系：DNA（8.5μL），兩種酶（各0.5μL），10×Tango Buffer（1μL），37 ℃酶切1h.酶切產(chǎn)物經(jīng)65 ℃熱水浴15 min 使酶失活.經(jīng)酶切鑒定正確的陽性克隆子，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序.

1.2.5 豬丹毒絲菌感受態(tài)制備

挑選豬丹毒絲菌單菌落接種于TSB 液體培養(yǎng)基（10 mL）中30℃培養(yǎng)16 h，取菌液（0.1 mL）轉接于TSB 液體培養(yǎng)基（10 mL），37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600=0.4），菌液經(jīng)30 min 冰浴后，分裝于預冷的離心管中，4 ℃離心（6 000 g/min）15 min 后，去上清，用預冷超純水重懸菌體沉淀，4 ℃離心（8 000 r/min）15min，重復兩次后，用500μL 14%預冷甘油溶液重懸細菌.

1.2.6 基因敲除菌的構建

將鑒定正確的敲除載體pUC18-LAR（10 μL）與豬丹毒絲菌感受態(tài)（100 μL）置于冰上輕柔的混勻10 min.混合物在1.25 kv、600 Ω、25 μF 的電轉參數(shù)下進行電轉化.電轉化后，用37 ℃預溫的TSB 培養(yǎng)基（950 μL，含馬血清5%）懸浮細菌，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h，離心（4 000 r/min）5 min 后涂布于TSB 瓊脂培養(yǎng)基（含5 μg/mL 氨芐青霉素）.

1.2.7 基因敲除株的鑒定

為檢測spaA 基因片段是否被抗性基因替換而缺失，挑取氨芐青霉素平板上的單菌落為模板，用表1的內引物IN-1/IN-2 和外引物OUT-1/ OUT-2 分別進行PCR 鑒定.反應體系：2×PCR Mix（5μL），引物（各0.5μL），豬丹毒絲菌野生株SG7 基因組DNA 或疑似菌DNA（1μL），ddH2O（8μL）.反應條件：94 ℃預變性 5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸4 min，30 個循環(huán)后終延伸72 ℃ 10 min.將引物OUT-1/OUT-2 PCR 擴增產(chǎn)物進行測序鑒定，獲得的基因敲除株暫命名為SG7ΔspaA.

1.2.8 小鼠毒力試驗

根據(jù)預試驗結果，將55 只BALB/c 小鼠隨機分成2 個大組，野生株SG7大組分5 個小組，敲除株SG7ΔspaA分為6 小組，每小組5 只.將兩種菌株培養(yǎng)后，采用10 倍梯度進行稀釋后攻毒，每只小鼠腹腔注射0.5 mL 梯度濃度菌液，對照鼠注射0.5 mL TSB液體培養(yǎng)基.對小鼠進行連續(xù)觀察并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，用Reed-Muench 法計算2 個菌株對小鼠的半數(shù)致死量.

2 結果分析

2.1 目的片段的擴增

目的片段的PCR 擴增結果見圖1，結果顯示上游片段L 長度大小為（1 107 bp），下游片段R 片段長度大小為（924 bp），Amp 抗性基因A 長度大小為（861 bp），與設計的片段大小一致.

圖1 目的片段的PCR擴增

圖2 重組載體pUC18-LAR 酶切鑒定電泳圖

2.2 敲除載體pUC18-LAR 的鑒定

pUC18-LAR 的酶切鑒定見圖2，結果顯示pUC18-L 用Hind Ⅲ+Pst Ⅰ雙酶切后獲得2 686 bp 和1 107 bp 兩 個 片 段，pUC18-LA 用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ雙 酶 切 后 獲 得2 686 bp 和1 968 bp 兩 個 片 段，pUC18-LAR 用Hind Ⅲ+Sma Ⅰ雙酶切后獲得2 686 bp、2 892 bp 兩個片段表明L、A、R 片段連接正確，測序結果表明3 個片段連接順序正確，無發(fā)生突變.

2.3 突變菌株的鑒定

基因敲除載體pUC18-LAR 電轉豬丹毒絲菌感受態(tài)細胞后，平板上長出若干單菌落，采用內引物IN-1/IN-2 進行菌落PCR 鑒定，結果見圖3，野生株能擴增出符合預期大小（1 402 bp）的條帶，有3 個菌落沒有擴增出條帶，可能為疑似敲除株，以這3 個疑似菌為模板用引物外引物OUT-1/OUT-2 鑒定，結果見圖4，以pUC18-LAR 作為陽性對照，結果顯示，只有一個疑似菌株擴增出與陽性對照一致大小的片段（2 365 bp），送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果說明此菌敲除成功.

圖3 內引物IN-1/IN-2 菌落PCR 鑒定結果

圖4 引物OUT-1/OUT-2 菌落PCR 鑒定結果

2.4 小鼠毒力試驗結果

野生株SG7 和敲除株SG7ΔspaA.對小鼠LD50（半數(shù)致死量）的測定統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2 和表3.根據(jù)Reed-Muench 法計算2 個菌株的半數(shù)致死量，野生株SG7 和敲除株SG7ΔspaA.對小鼠LD50 的分別為7.3×103CFU/mL 和7.45×105CFU/mL，與野生株相比敲除株SG7ΔspaA. 對小鼠的毒力降低102 倍.

表2 野生株SG7 株對小鼠LD50 的測定

表3 敲除株SG7ΔspaA 對小鼠LD50 的測定

3 討論

豬丹毒為散發(fā)性或地方流動性傳染病，有時也出現(xiàn)爆發(fā)性流行，各種年齡和品種的豬均易感，給全球各地的養(yǎng)殖業(yè)帶來影響.有研究通過對比不同年代菌株的基因發(fā)現(xiàn)spaA 基因為保守基因，同源性近100%［12-13］.SpaA 是豬丹毒絲菌的主要免疫保護性抗原，幾乎存在于所有毒力較強的菌株中，主要的保護功能核心區(qū)段為氨基端，且是由抗體介導的免疫保護［14-17］.SpaA 本實驗構建了spaA 基因敲除載體，與spaA 基因上下游序列有部分同源序列，通過同源重組使得spaA 基因被敲除.電穿孔轉化具有轉化率高，幾乎所有的細菌都有一套與之匹配的電穿孔操作條件的優(yōu)點，故本實驗利用該方法將豬丹毒絲菌spaA 基因敲除載體pUC18-LAR 導入野生株SG7 獲得基因敲除株SG7ΔspaA.敲除株SG7ΔspaA 相較于野生株對小鼠的毒力降低了102 倍，與豬丹毒絲菌的致病性有關.為其致病機制和相關的疫苗研發(fā)奠定了一定的基礎.

4 結論

測序結果表明豬丹毒絲菌敲除株SG7ΔspaA 構建成功.通過小鼠毒力實驗證明，敲除株SG7ΔspaA 相較于野生株對小鼠的毒力降低了102 倍，證實SpaA 確實與豬丹毒絲菌的致病性有關，為后繼的相關實驗提供一定的參考.