沈 汶蔣卓霖吳雨晴梁 杰郝宣潤(rùn)雷奇林

（1.成都醫(yī)學(xué)院，四川 成都610050； 2.四川科瑞德制藥股份有限公司，中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州646100）

金銀花屬于寒性植物，為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb 干躁花蕾或帶初開的花，為常用中藥。具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效，主治癰腫、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等癥，應(yīng)用歷史悠久［1］。黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為唇形科多年生草本植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根。其味苦、性寒，具有清熱燥濕、止血安胎、瀉火解毒、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒等功效［2］。用銀黃配伍制成的銀黃制劑具有清熱解毒、消炎之功效，通常用于治療上呼吸道感染、扁桃體炎、燒傷燙傷感染等［3］。現(xiàn)在銀黃藥對(duì)配伍研究主要集中于銀黃藥對(duì)的主成分研究、質(zhì)量控制及藥理作用研究［4-6］等方面。而病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)要成功的復(fù)制需要宿主細(xì)胞的細(xì)胞因子參與，對(duì)于其復(fù)雜作用機(jī)制的研究有助于理解宿主細(xì)胞中細(xì)胞因子在病毒復(fù)制過程中的作用，并指導(dǎo)相關(guān)抗病毒新藥開發(fā)［7］。但目前尚未見對(duì) 銀黃藥對(duì)抗病毒的作用機(jī)制報(bào)道。因此，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究銀黃藥對(duì)抗病毒作用機(jī)制及其物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 銀黃藥對(duì)成分篩選 通過文獻(xiàn)調(diào)研與挖掘的方法，選取金銀花［8-10］與黃芩［11-13］中主要質(zhì)量控制與藥效成分共16種，見表1。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)［14］（TCMSP，http： ／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php） 與PubChem （https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ／）［15］查找并導(dǎo)出16 種化學(xué)分子的三維化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，保存為?.mol2 文件格式。

1.2 銀黃藥對(duì)主要活性成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 黃芩主要含有黃酮類成分（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等），金銀花主要含有綠原酸及其異構(gòu)體等有機(jī)酸（綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡?？鼘幩帷?，4-二咖啡酰奎寧酸） 和苷類物類（金絲桃苷、木犀草素、忍冬苷、檞皮素）。將導(dǎo)出的化合物分子結(jié)構(gòu)以mol2 （?.mol2） 文件格式提交到PharmMapper 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（http： ／ ／59.78.96.61／pharmmapper／） 進(jìn)行反向?qū)右灶A(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)。PharmMaper 是根據(jù)反向藥效團(tuán)匹配法，實(shí)現(xiàn)預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)與生物活性成分的對(duì)接的服務(wù)器。其會(huì)對(duì)BindingDB、Targetbank、PDTD、Drugbank 4 大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索以獲取藥物潛在靶點(diǎn)的信息，這使得預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信息更加可靠精確［16］。將選擇靶點(diǎn)集（select target set）設(shè)置為“僅人類蛋白質(zhì)靶點(diǎn)” ［human protein targets only（v2010，2241）］，其余參數(shù)不變。下載每個(gè)成分的反向?qū)宇A(yù)測(cè)結(jié)果，將對(duì)接得分Z 值（Z scores） 以降序排列，依據(jù)其對(duì)接得分選取每個(gè)成分的前20 個(gè)靶點(diǎn)作為靶點(diǎn)與該化合物相關(guān)的重要靶點(diǎn)。由于PharmMapper 對(duì)接結(jié)果中的藥物靶點(diǎn)存在命名不規(guī)范以及為方便進(jìn)行下一步研究，因此本文采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索功能（http： ／ ／www.uniprot.org ／）［17］，將得到的靶點(diǎn)代碼統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為人源基因代碼［Organism： Homo sapiens （Human）］。如將Cell division protein kinase 6、Angiogenin、Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src 分別轉(zhuǎn)換為CDK6、ANG、SRC。在經(jīng)過轉(zhuǎn)換之后，獲取活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)信息。

1.3 藥物-化合物-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選 將銀黃藥對(duì)中藥物、活性成分、預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscope3.4.0 軟件（http： ／ ／www.cytoscape.org ／） 中構(gòu)建藥物-化合物-預(yù)測(cè)靶點(diǎn) （Drug-compound-predicted target network，DCTN） 網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape 是一個(gè)開放源碼的生物信息分析軟件，其核心架構(gòu)是網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)（node） 表示的是基因、蛋白質(zhì)或分子，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的邊（edge） 則代表這些它們之間的相互作用，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值（degree） 表示網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)相連的數(shù)目，度值越大，則這個(gè)靶點(diǎn)越有可能是化合物的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。使用Cytoscope3.4.0 軟件中的網(wǎng)絡(luò)分析工具（NetworkAnalyzer）計(jì)算藥物-化合物-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，這些參數(shù)包括了度值、介數(shù) （betweeness centralit，BC） 等。BC 表示節(jié)點(diǎn)在特定網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲兴械淖疃搪窂街薪?jīng)過該節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，反應(yīng)了節(jié)點(diǎn)在特定網(wǎng)絡(luò)中的樞紐程度。參考度值及BC 可以確定網(wǎng)絡(luò)中的主要節(jié)點(diǎn)，進(jìn)而確定關(guān)鍵靶點(diǎn)［18］。因此本文通過分析網(wǎng)絡(luò)，確定銀黃藥對(duì)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)-關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用分析 為了闡明預(yù)測(cè)靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，將銀黃藥對(duì)16 種主要活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)上傳至String 10.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https： ／ ／stringdb.org／），獲取相關(guān)蛋白相互作用信息。String 是一個(gè)貯存蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)，每一個(gè)蛋白質(zhì)都會(huì)有一個(gè)相互作用的打分值，打分值高的則置信度高［19］。選取打分值大于0.9 作為蛋白之間相互作用的高置信度依據(jù)，得到關(guān)鍵靶點(diǎn)-關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)（Key protein-protein interaction network，KPPN）。

1.5 關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)位點(diǎn)的確定 蛋白質(zhì)的表達(dá)位置能反應(yīng)該蛋白質(zhì)的功能，本文使用人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（http： ／ ／www.proteinatlas.org）［20］分析蛋 白質(zhì)的 表達(dá)位置。由于與抗病毒作用的靶點(diǎn)主要表達(dá)于免疫系統(tǒng)，因此本文統(tǒng)計(jì)關(guān)鍵蛋白在骨髓與免疫系統(tǒng)中的表達(dá)情況。

1.6 KEGG 通路富集分析 利用DAVID v6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)［21］對(duì)KPPN 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 生物通路富集分析。將關(guān)鍵基因列表粘貼至DAVID v6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)中，以人類全基因組為背景基因和參照集合，獲得通路富集結(jié)果。

1.7 構(gòu)建藥物-成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)-KEGG 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscope3.4.0 軟件構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)-KEGG 信號(hào)通路（Key target-KEGG signaling pathway network，KTKN），并使用Cytoscope3.4.0 軟件Merge 功能將DCTN 與KPPI 以及KTKN 網(wǎng)絡(luò)融合，得到藥物-化合物-關(guān)鍵靶點(diǎn)-KEGG 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò) （Drug-compound-key target-KEGG signaling pathway network，DCTK）。

2 結(jié)果

2.1 銀黃藥對(duì)成分篩選 通過文獻(xiàn)挖掘，以主要質(zhì)量控制標(biāo)志物、藥效成分為指標(biāo)，共篩選出16 種成分。其中金銀花中有10 種成分，包括綠原酸及其異構(gòu)體等有機(jī)酸和苷類物質(zhì)。黃芩中共6 種成分，主要為黃芩苷等黃酮類成分。見表1。

表1 銀黃藥對(duì)16 種活性成分

2.2 化合物-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選 銀黃藥對(duì)的藥物-成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖1。該網(wǎng)絡(luò)圖中含有175 個(gè)節(jié)點(diǎn)（2 個(gè)藥物、16 種成分、157 個(gè)靶點(diǎn)） 組成599條相互作用關(guān)系在銀黃藥對(duì)的藥物-成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中，靶點(diǎn)的平均度值為3.45，平均拓?fù)湎禂?shù)為0.013 6。以度值大于平均度值，拓?fù)湎禂?shù)大于平均拓?fù)湎禂?shù)的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，其信息見表2。這些靶點(diǎn)中，度值最高的是血管生成蛋白質(zhì)（angiogeninA，ANG），能與其它8 個(gè)節(jié)點(diǎn)相互作用；其次是度值為5 的靶點(diǎn)共計(jì)8 個(gè)，包括1 型非受體酪氨酸蛋白磷酸酶（Tyrosine-protein phosphatase nonreceptor type 1，PTPN1）、胰 腺 α-淀粉酶 （Pancreatic α-amylase，AMY2A）、絲氨酸／蘇氨酸-蛋白激 酶Chk1（Serine／threonine-protein kinase Chk1，CHEK1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src （Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC）、細(xì)胞分裂蛋白激酶7 （Cell division protein kinase 7，CDK7）、細(xì)胞分 裂蛋白激酶2 （Cell division protein kinase 2，CDK2）、ADP-核糖基環(huán)化酶2 （ADPribosyl cyclase 2，BST1）、二氫葉酸還原酶（Dihydrofolate reductase，DHFR）。在藥物-化合物-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，每種藥物含有多種成分，每一種成分能作用于多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)又能與其它多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生相互作用，這體現(xiàn)了中藥多成分-多靶點(diǎn)的共同作用機(jī)制與整體性的治療思路。

圖1 銀黃藥對(duì)的藥物-成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 銀黃藥對(duì)的藥物-成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析 將篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入String 10.0 數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到關(guān)鍵蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（KPPI）。這些靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系如圖2所示。在KPPI 網(wǎng)絡(luò)中，DHFR、CDK7、CHEK1、CCNA2、CDK2、SRC、PTPN1 幾個(gè)蛋白質(zhì)之間存在較為密切的相互作用，這提示銀黃藥對(duì)在發(fā)揮抗病毒作用時(shí)可能通過這些靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用，同時(shí)也提示著各成分之間可能存在的協(xié)同作用。

2.4 關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)位點(diǎn)的確定 排除掉與其他靶點(diǎn)沒相互作用的靶點(diǎn)，將剩余的關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中，統(tǒng)計(jì)出各個(gè)靶點(diǎn)在人體骨髓與免疫系統(tǒng)中的表達(dá)情況，如表3 所示。從表3 可以看出，相關(guān)靶點(diǎn)在骨髓與免疫系統(tǒng)中表達(dá)程度較高，從側(cè)面印證了銀黃藥對(duì)具有較好的抗病毒效果。

2.5 KEGG 信號(hào)通路富集分析 7 個(gè)靶點(diǎn)主要涉及到5 條信號(hào)通路（表4）。這5 條通路中，2 條通路與抗病毒作用有關(guān)，包括病毒致癌通路（Viral carcinogenesis） 和乙型肝炎通路（Hepatitis B）；2 條與細(xì)胞增殖有關(guān)，包括細(xì)胞周期信號(hào)通路（Cell cycle）、細(xì)胞粘連信號(hào)通路（Adherens junction）；一條與轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，即信號(hào)通路p53 信號(hào)通路（p53 signaling pathway）。以P＜0.05 為功能顯著性與通路富集臨界值，篩選出與抗病毒相關(guān)的信號(hào)通路，病毒致癌通路（Viral carcinogenesis）、乙肝病毒通路（Hepatitis B）。

圖2 關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)在人體各組織表達(dá)

2.6 藥物-成分-靶點(diǎn)-KEGG 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的建立 使用Cytoscope3.4.0 軟件構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)-KEGG 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)（Key target -KEGG signaling pathway network，KKN），并用Cytoscope3.4.0 軟件Merge 功能將DCTN 與KPPI 以及KKN網(wǎng)絡(luò)融合，得到藥物-成分-靶點(diǎn)-KEGG 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)（DCTK），見圖4，顯示了藥物、成分、靶點(diǎn)、KEGG 信號(hào)通路之間的關(guān)系。從圖中可以看出，在篩選出來的兩條信號(hào)通路中，銀黃藥對(duì)中共有5 種成分（金銀花3 種，黃芩2種） 可以作用于這些通路中的關(guān)鍵蛋白，這提示這些成分可能是銀黃藥對(duì)中發(fā)揮抗病毒作用的主要成分。

表4 銀黃藥對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG 信號(hào)通路富集分析

圖4 藥物-成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-KEGG 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道銀黃藥對(duì)常用制劑如銀黃顆粒［5］、復(fù)方銀黃口服液［22］、銀黃注射液［23］等具有體內(nèi)、體外抗病毒作用。主要成分包括綠原酸、木犀草素、隱綠原酸、黃芩苷、黃芩素等，這與本研究結(jié)果一致。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩中的2s-5，7，2′，6′-四羥基黃酮可能也具有抗病毒作用，目前已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道了該化合物具有抗菌作用［24］。

CDK2、CDK7、SRC、DHFR、CHEK1、CCNA2 等幾個(gè)靶點(diǎn)是銀黃藥對(duì)抗病毒的主要作用靶點(diǎn)。銀黃藥對(duì)中的有效成分既可通過直接作用于某一靶點(diǎn)而發(fā)揮抗病毒作用；也可通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)，通過各靶點(diǎn)的相互作用而間接發(fā)揮抗病毒作用。CDK2 與CDK7 是細(xì)胞周期素依賴性激酶家族成員，與細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)，作用于中心體與DNA的復(fù)制過程。CDK2 能夠使CTNNB1、CDK7、p53／TP53 等蛋白質(zhì)磷酸化，在G1-S 發(fā)揮作用。通過使得cyclin B／CDK1磷酸化來調(diào)控cyclin B／CDK1 在中心體與細(xì)胞核中的激活，進(jìn)而控制進(jìn)入有絲分裂與減數(shù)分裂的時(shí)期。CDK 家族與多種重要的人類疾病病毒的復(fù)制密切相關(guān)［25］。在CDK2 功能缺陷型的宿主細(xì)胞中，病毒的復(fù)制具有感染劑量依賴性，當(dāng)CDK2 活性被誘導(dǎo)激活時(shí)，病毒進(jìn)入快速的裂解性復(fù)制。因此推測(cè)銀黃藥對(duì)中的有效成分（如綠原酸、木犀草素、隱綠原酸） 能夠抑制CDK2、CDK7 的表達(dá)而抑制病毒在人體內(nèi)的復(fù)制過程，進(jìn)而達(dá)到抗病毒的作用。SRC 是一種非受體蛋白酪氨酸激酶。SRC 在病毒感染與腫瘤疾病方面起著重要作用，例如乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）可通過介導(dǎo)SRC 激酶活化以及SRC 激酶家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，為HBV 在哺乳動(dòng)物肝臟內(nèi)病毒復(fù)制提供關(guān)鍵功能［26］。因此推測(cè)銀黃藥對(duì)中的有效成分能抑制SRC 激酶的活化并阻斷相關(guān)信號(hào)通路達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用。CCNA2 編碼一種細(xì)胞周期蛋白A2，能夠控制細(xì)胞周期中的G1／S 和G2／M 過渡階段。其作用機(jī)制是通過與CDK1 與CDK2 形成絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶全酶復(fù)合物，賦予這些復(fù)合物的底物特異性［27］。因此推測(cè)銀黃藥對(duì)中的有效成分可能通過CCNA2進(jìn)而調(diào)節(jié)CDK2 而達(dá)到抗病毒的目的。DHFR 編碼二氫葉酸還原酶（Dihydrofolate reductase），二氫葉酸還原酸是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，能夠催化DNA 前體合成的必要反應(yīng)。因此推測(cè)銀黃藥對(duì)中的有效成分通過抑制二氫葉酸還原酶的表達(dá)，進(jìn)而抑制DNA 前體的合成而達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用。CHEK1 能夠編碼絲氨酸／蘇氨酸蛋白質(zhì)酶1 （Serine／threonine-protein kinase Chk1），其在由檢查點(diǎn)介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯與DNA 修復(fù)中是必須的。有研究證明，用CHK 抑制劑處理產(chǎn)生的細(xì)胞可以保護(hù)它們免受病毒介導(dǎo)的毒性并減少后代病毒的滴度［28］。因此推測(cè)銀黃藥對(duì)中的有效成分通過抑制CHEK1 的表達(dá)，能夠減少病毒對(duì)細(xì)胞DNA 的損害并修復(fù)受損的DNA，同時(shí)減少細(xì)胞受到的病毒毒性作用。

本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法報(bào)道銀黃藥對(duì)的抗病毒作用。發(fā)現(xiàn)銀黃藥對(duì)抗病毒的作用機(jī)制可能是直接或間接抑制與病毒復(fù)制相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)，抑制DNA 前體合成而抑制病毒的復(fù)制，減少宿主細(xì)胞DNA 受損并修復(fù)受損的DNA，減少宿主細(xì)胞受到的病毒毒性作用。但需要指出的是，本文研究結(jié)果仍需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證明。