劉艷，邢莎莎*，楊進，雷霞，楊雨婷，陳林，王凱

(成都大學附屬醫(yī)院：1藥物臨床試驗中心，2泌尿外科，成都 610081)

心血管疾病是發(fā)達國家主要的致死性疾病。隨著年齡增加， 心血管疾病的發(fā)病率呈顯著上升趨勢[1]。心臟的老化是一個復雜的病理生理過程，伴隨著多種生物學現(xiàn)象的發(fā)生，主要表現(xiàn)為心臟舒張

功能紊亂、心臟肥大、纖維化和收縮功能受損[2]。心臟纖維化伴隨衰老進程，加速心臟損傷[3]。在衰老的小鼠和人的心臟中，纖維連接蛋白和膠原顯著增加，衰老的心肌成纖維細胞纖維化信號和膠原形成顯著增加[4]。心臟膠原堆積引起心室過度纖維化，進一步引起心肌硬化，導致了心臟舒張功能障礙[5]。炎性小體作為慢性、低水平、無菌性炎癥的主要感受器，在衰老相關心血管疾病中的作用受到廣泛關注[6]。但是，在老年大鼠心臟中，缺乏炎癥小體活化的直接證據(jù)。本研究旨在觀察衰老所致大鼠心臟的膠原沉積和炎癥小體活化的變化，旨在為衰老導致的心臟組織肥大和炎癥提供直接的實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

半胱天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)抗體、白介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)抗體購于德國Abcam公司；p16抗體、p21抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購于武漢三鷹生物技術有限公司；蘇木素、麗春紅、二氨基聯(lián)苯胺染色液(diaminobenzidine，DAB)染色液購于武漢塞維爾生物科技有限公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物

SD大鼠10只，均為雌性[7]：正常飼養(yǎng)20個月的大鼠作為老年組，正常飼養(yǎng)8周齡的大鼠作為青年組，每組5只。采用異氟烷進行麻醉，取大鼠心臟組織，冰磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗后，4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，檢測相關指標。

1.3 方法

1.3.1 Masson染色 切片經(jīng)蘇木素染細胞核、麗春紅染色、磷鉬酸處理，苯胺藍染色，分化，脫水封片。采用Pannoramic MIDI掃描儀行全波長掃描(3D HISTECH，匈牙利)，膠原纖維呈藍色，觀察心臟組織膠原沉積情況。

1.3.2 免疫組織化學染色 切片脫石蠟后，行免疫組織化學染色，具體步驟如下：抗原修復后阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加入牛血清蛋白(bull serum albumin，BSA)封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗孵育后，加入DAB顯色。蘇木素復染后脫水封片，Pannoramic MIDI掃描儀行全波長掃描。蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。濃度為：IL-1β抗體1∶100；p16抗體1∶50；p21抗體1∶50。

1.3.3 免疫熒光染色 切片脫蠟至水、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗原修復、血清封閉，加一抗4℃孵育過夜，洗滌一抗后，加二抗室溫孵育50 min，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復染細胞核，封片，切片，于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像(紅光激發(fā)波長510～560 nm，發(fā)射波長590 nm)。

1.4 圖像分析

采用Image-pro plus 6.0軟件對圖像進行分析，每張切片隨機選擇5個視野進行分析，自動計算光密度值，取平均光密度值用于各組之間比較。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 增齡對大鼠心臟組織肥大和膠原沉積

與青年大鼠相比，老年大鼠的心臟體積顯著增大(圖1A)。Masson染色結果顯示，衰老大鼠心臟組織膠原沉積明顯增加[(12.54±2.8)%和(45.12±7.63)%]，提示隨著衰老進程，心肌組織膠原沉積，纖維化導致心臟組織肥大(圖1B，C)。

2.2 增齡對大鼠p16和p21蛋白表達的影響

與青年組大鼠相比，老年組大鼠心臟組織衰老標志p16[(21.45±5.21)%和(38.71±6.89)%]和p21[(19.23±7.32)%和(41.01±10.21)%]蛋白的表達均顯著增加(P<0.05；圖2)，提示隨著年齡增長，心臟細胞呈現(xiàn)衰老的特性。

2.3 增齡對大鼠心臟組織IL-1β表達的影響

與青年組大鼠相比，老年組大鼠心臟組織炎癥標志蛋白IL-1β表達顯著增加[(5.27±1.02)%和(14.62±3.87)%]，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖3)，提示隨著年齡增長，心臟細胞呈現(xiàn)炎癥特性。

2.4 增齡對大鼠心臟組織Caspase-1蛋白表達的影響

隨著衰老進程，大鼠心臟組織Caspase-1蛋白表達顯著增加[(10.23±7.12)%和(42.01±8.91)%]，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖4)，提示炎癥小體活化是誘導心臟組織衰老的關鍵機制。

3 討 論

心臟纖維化是指心臟組織內(nèi)結締組織增多和實質(zhì)細胞減少的病理變化，是多種心血管疾病的共同病理特征，纖維化導致的心臟功能衰竭是患者致死和致殘的主要原因[8]。衰老是心肌組織纖維化和組織重構的關鍵風險因子，在增齡相關的高血壓、肥厚性心肌病和心肌缺血等心血管疾病中，均存在心臟膠原沉積和纖維化改變[9]。目前對于自然衰老進程中心臟組織重構的機制尚未被闡明。

圖1 增齡誘導大鼠心臟組織肥大和膠原沉積

A: representative image for rat heart; B, C: Masson-trichrome staining (scale bar=100 μm) and quantitative analysis of collagen deposition,respectively. Compared with young group,**P<0.01.

圖2 2組大鼠p16和p21蛋白表達的比較

圖3 2組大鼠IL-1β蛋白表達的比較

A: immunohistochemical staining (scale bar=100 μm); B: quantitative analysis. IL-1β: interleukin-1 beta. Compared with young group,*P<0.05.

圖4 2組大鼠Caspase-1蛋白表達的比較

A: immunofluorescence staining (scale bar=100 μm); B: quantitative analysis. Compared with young group,*P<0.05.

衰老機體持續(xù)存在低水平、慢性、無菌性炎癥，可以通多種作用損害免疫系統(tǒng)活化，因此，調(diào)節(jié)炎癥代謝物可能是干預年齡相關疾病的重要方式[10]。研究表明，炎癥小體是慢性、低水平、無菌性炎癥的主要感受器。在機體受到外界病原微生物侵襲或自身發(fā)出“危險信號”時，NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)或黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)分子被激活，組成蛋白復合體，并招募Pro-Caspase-1，導致其局部高濃度，發(fā)生自體水解，隨后形成異二聚體，進一步聚合形成四聚體，成為有活性的Caspase-1。Caspase-1剪切無活性的pro-IL-1β，促進其成熟及分泌[11,12]。在衰老相關的心血管疾病中，均發(fā)現(xiàn)了炎癥小體的活化，但對于自然衰老的心臟中是否存在炎癥小體活化尚未見相關報道。

本研究證實，在自然衰老進程中，存在Caspase-1活化和IL-1β炎癥介質(zhì)釋放，提示炎癥小體活化導致的炎癥可能是導致自然衰老的關鍵機制，抑制炎癥小體活化有望成為干預心臟膠原沉積和心臟老化的新靶點。