師志云，郭雅琪，江海峰，張玉英，趙 玥，趙倩穎，何學(xué)虎，梁小燕，董 潔，賈 偉△

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，寧夏銀川 750004；2.寧夏臨床病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科，寧夏銀川 750004

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，《2018年美國癌癥統(tǒng)計(jì)》報(bào)告中指出2018年美國將出現(xiàn)173.5萬例癌癥新發(fā)病例和60.9萬例癌癥死亡病例，其中肺癌發(fā)病人數(shù)為12.1萬例(14%)，死亡人數(shù)為11.2萬例(13%)[1]?！禔 Cancer Journal for Clinicians》公布了2015年中國有429.2萬新發(fā)腫瘤病例和281.4萬腫瘤死亡病例[2]，肺癌是癌癥死因之首。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占原發(fā)性肺癌的85%[3]，臨床上大部分患者確診時已為晚期[4]，失去了最佳手術(shù)治療時機(jī)。

隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療藥物如小分子表皮生長因子酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKI)的出現(xiàn)[5-6]，為NSCLC患者帶來曙光。研究報(bào)道，EGFR基因突變是EGFR-TKI敏感的重要預(yù)測因子[7]。本試驗(yàn)采用的擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)法是目前檢測 EGFR基因突變最為敏感的方法，對2014年1月至2017年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的225例NSCLC患者進(jìn)行EGFR基因突變檢測，并對其不同性別、年齡、民族、年份、季節(jié)、標(biāo)本類型及病理類型進(jìn)行比較分析，為判斷疾病發(fā)展過程、預(yù)后及EGFR-TKI靶向治療提供分子病理學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年1月至2017年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院住院的首次確診或術(shù)后復(fù)發(fā)的晚期NSCLC患者225例為研究對象，其中男117例，女108例；年齡23～85歲，平均(58.9±11.0)歲；225例標(biāo)本中組織石蠟切片201例，胸腔積液細(xì)胞蠟塊24例；病理類型中腺癌204例，鱗癌12例，腺鱗癌6例，大細(xì)胞癌3例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為NSCLC；(2)在2014年1月1日至2017年12月31日首次確診或術(shù)后復(fù)發(fā)的晚期NSCLC住院患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)沒有病理確診的NSCLC患者；(2)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的其他情況的患者。

1.2試劑與儀器 FFPE DNA提取試劑盒(中國廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)、人類EGFR基因29種突變熒光PCR檢測試劑盒(中國廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，DS-11微量核酸蛋白濃度測定儀(美國DeNovix公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 手術(shù)石蠟切片及細(xì)胞石蠟標(biāo)本均經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生進(jìn)行質(zhì)量評估，切取5～8張白片，裝于EP管內(nèi)，立即進(jìn)行DNA提取。

1.3.2DNA提取 嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3.3DNA純度及水平測定 A260/A280在1.8～2.0，DNA水平調(diào)整至2 ng/μL。

1.3.4ARMS-PCR檢測 ARMS-PCR對EGFR基因編碼區(qū)的4個外顯子29種突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，所有試驗(yàn)均設(shè)陰、陽性對照。

1.3.5結(jié)果判讀 嚴(yán)格按照試劑盒說明書提供的檢驗(yàn)結(jié)果的解釋進(jìn)行判讀。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1EGFR基因突變率及突變類型 225例患者中，EGFR基因共突變113例，總突變率為50.22%(113/225)。其中，最常見突變?yōu)?9、21外顯子，突變亞型最多的為19-del，共48例(21.33%)，其次為21-L858R，共40例(17.78%)。EGFR基因各種突變類型突變率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=148.209，P<0.05)，見表1。在113例突變中，共發(fā)現(xiàn)10例雙位點(diǎn)突變，包括3例L858R和T790M雙突變，2例G719X和S768I雙突變，其余雙突變(19-del和S768I，L858R和S768I，19-del和T790M，G719X和L861Q，G719X和T790M)各1例。

表1 EGFR基因突變率及突變類型

注：EGFR基因各種突變類型突變率相比，χ2=148.209，P<0.05。

2.2EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系 225例患者中，男、女突變率分別為41.03%(48/117)和50.93%(55/108)，兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；<60歲與≥60歲、漢族與回族突變率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2014年(63.89%)至2017年(30.19%)EGFR基因突變率有明顯下降趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同季節(jié)中，春季突變率最高(53.57%)，冬季突變率最低(34.55%)，四季突變率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3EGFR基因突變與病理特征的關(guān)系 225例患者中，組織石蠟切片EGFR基因突變率46.27%(93/201)，胸腔積液細(xì)胞蠟塊突變率41.67%(10/24)，兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病理類型中，腺癌標(biāo)本占90.67%(204/225)，EGFR基因突變率最高，占49.02%(100/204)，各種病理類型突變率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系

表3 EGFR基因突變與病理特征的關(guān)系

注：4種病理類型突變率相比，χ2=13.578，P<0.05。

3 討 論

近年來，隨著分子信號傳導(dǎo)通路在NSCLC發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中研究的深入，相應(yīng)靶向藥物的驅(qū)動基因包括EGFR基因、間變性大細(xì)胞淋巴瘤激酶(ALK) 融合基因、酪胺酸蛋白激酶(ROS1)基因重排逐漸成為熱點(diǎn)，使NSCLC的治療進(jìn)入分子靶向治療時代，且逐步實(shí)現(xiàn)個體化治療。

EGFR是一種跨細(xì)胞膜糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因，其突變及過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、活動性、粘連性、侵襲性、凋亡抑制和血管生成相關(guān)[8]。2017年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南[9]中建議對中晚期NSCLC患者進(jìn)行EGFR基因常規(guī)檢測，對于敏感突變患者推薦靶向藥物作為一線治療藥物。目前EGFR-TKI已通過美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的藥物有一代吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)等，二代阿法替尼(afatinib)和三代奧西替尼(osimertinib)等[10]。

既往研究表明，NSCLC患者的EGFR基因突變率在不同國家、地區(qū)存在一定差異，亞洲人種EGFR基因突變率(51.4%)高于北美或歐洲(10%左右)，且以女性、非吸煙、腺癌患者為主，達(dá)70%～80%[11-12]。本研究225例患者均采用ARMS-PCR進(jìn)行EGFR基因突變檢測，EGFR基因總突變率達(dá)50.22%(113/225)，其中包括男性患者發(fā)生突變48例，突變率41.03%(48/117)；女性患者發(fā)生突變55例，突變率50.93%(55/108)，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，考慮可能與樣本量不大有關(guān)。<60歲突變率39.25%(42/107)與≥60歲突變率51.69%(61/118)相比，漢族突變率45.03%(86/191)與回族突變率50.00%(17/34)相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；春季(3-5月)突變率最高(53.57%)，冬季(12-2月)突變率最低(34.55%)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2014-2017年EGFR基因突變率有明顯下降趨勢，從63.89%下降到30.19%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

董強(qiáng)剛等[13]將176例NSCLC患者行EGFR基因檢測，其中腺癌組患者中EGFR基因突變率為44.8%(30/67)，腺鱗癌組患者EGFR基因突變率為33.3%(10/30)，鱗癌組患者突變率為20.3%(13/64)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EGFR基因突變在腺癌(或腺鱗癌)中突變率更高。本研究中，腺癌204例，突變100例，突變率49.02%；腺鱗癌6例，突變2例，突變率33.33%；鱗癌12例，突變1例，突變率8.33%，3種病理類型突變率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究EGFR基因突變在腺癌的NSCLC中更為常見，腺癌、腺鱗癌EGFR突變率與國內(nèi)其他報(bào)道相符[13-14]。

既往研究報(bào)道，EGFR基因不同突變位點(diǎn)的生物學(xué)功能各有不同，外顯子18、19及21發(fā)生突變的NSCLC對EGFR-TKI具有良好療效，外顯子20中T790M突變是形成EGFR-TKI繼發(fā)性耐藥的重要機(jī)制之一[15]，且最常見突變?yōu)?9號外顯子的缺失突變19-del和21號外顯子的L858R點(diǎn)突變[16]。WEI等[17]分析廣西NSCLC患者EGFR基因突變率為35.7%(537/1 506)，且最常見的突變亞型為19-del(293/1 506，19.5%)和L858R(227/1 506，15.1%)，并分析這兩個突變位點(diǎn)在性別、吸煙情況、病理類型方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在HSIEH等[18]的研究中，21號外顯子突變所占比例更大(13/17，76.47%)。本研究中， 19-del缺失突變率為21.33%(48/225)，L858R點(diǎn)突變率為17.78%(40/225)，20外顯子T790M耐藥突變率為3.56%(8/225)，20外顯子20-Ins插入突變(非敏感突變)突變率為1.33%(3/225)，同時發(fā)現(xiàn)10例EGFR基因雙位點(diǎn)突變。EGFR基因總突變率與文獻(xiàn)報(bào)道一致，只是突變類型比例稍有不同，考慮與樣本量及人群選擇有關(guān)。

因此，NSCLC患者中EGFR基因存在較高的突變率，其基因突變分型有助于篩選出適合EGFR-TKI腫瘤靶向治療的人群，指導(dǎo)臨床個體化用藥及減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。