張海宇，張 珂

四川省腫瘤醫(yī)院輸血科,四川成都 610041

目前已確認(rèn)的人類(lèi)血型系統(tǒng)已達(dá)36個(gè)[1],Rh血型系統(tǒng)是其中最復(fù)雜的血型系統(tǒng)，包含了54種Rh血型抗原[2]。5種主要Rh抗原，即D、C、E、c和e與臨床輸血有密切關(guān)聯(lián)。由于Rh系統(tǒng)具有遺傳多態(tài)性，不同種族、地域、人群Rh血型抗原分布頻率不盡相同,產(chǎn)生的不規(guī)則抗體也具有差異性。Rh血型的免疫原性強(qiáng)度僅次于ABO血型抗原,在Rh抗原中免疫原性以D為最強(qiáng)，E次之[3]。血清中天然抗-E或免疫產(chǎn)生IgM、IgG抗-E的患者時(shí)有報(bào)道。

MNS血型系統(tǒng)中的Miltenberger亞系統(tǒng)有10種不同的低頻率抗原，Mur抗原是其中之一?？?Mur引起的輸血反應(yīng)在臨床上與ABO不合的輸血反應(yīng)相似，都屬于急性溶血性輸血反應(yīng)[4]；也有遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)以及嚴(yán)重的新生兒溶血病。

筆者近期在上海市血液中心《免疫性血液學(xué)培訓(xùn)班》學(xué)習(xí)期間，遇到1例胚胎移植孕婦患者，血清中檢出IgG 抗-E合并IgG抗-Mur，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 胚胎移植孕婦周某某，女，32歲，2003年輸血200 mL紅細(xì)胞懸液，曾孕0產(chǎn)0，無(wú)藥物過(guò)敏史，現(xiàn)體外受精胚胎移植(俗稱(chēng)試管嬰兒)，已孕37周，血型B型，RhD陽(yáng)性，2018年7月9日當(dāng)?shù)蒯t(yī)院產(chǎn)檢，發(fā)現(xiàn)抗體篩選陽(yáng)性(但當(dāng)?shù)蒯t(yī)院未進(jìn)一步抗體鑒定)，2018年11月孕婦腹痛出血就診，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院及時(shí)向上海市血液中心參比實(shí)驗(yàn)室申請(qǐng)抗體鑒定。

1.2儀器與試劑 強(qiáng)生AutoVue?全自動(dòng)血型及配血分析系統(tǒng)：BioVue?孵育器和BioVue?離心機(jī)、強(qiáng)生單抗卡(批號(hào):2GC719A)、KA-2200血型專(zhuān)用離心機(jī)(日本 KUBOTA 公司生產(chǎn))、抗體篩選細(xì)胞(批號(hào)：20187036)、抗體鑒定十系譜細(xì)胞(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20180914)、抗體鑒定十六系譜細(xì)胞(Sanquin，批號(hào)：20181220)、木瓜酶試劑(試管分裝凍融后備用1 mL)。

1.3方法 采用的方法有血型鑒定、不規(guī)則抗體篩選、不規(guī)則抗體鑒定、鹽水經(jīng)典抗人球蛋白試驗(yàn)、微柱凝膠卡抗人球蛋白試驗(yàn)及抗體效價(jià)測(cè)定、二步酶法等，按照上海市血液中心血型參比實(shí)驗(yàn)室SOP操作。

2 結(jié) 果

2.1血型鑒定 該孕婦患者ABO表型：B型；Rh表型：CCDee。

2.2不規(guī)則抗體篩選 孕婦血清與篩選細(xì)胞室溫鹽水抗體篩查試驗(yàn)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號(hào)篩選細(xì)胞立即離心均陰性，自身對(duì)照陰性，二次離心也均是陰性，進(jìn)一步抗球蛋白試驗(yàn)Ⅰ號(hào)1+w、Ⅱ號(hào)-、Ⅲ號(hào)1+w，聚凝胺增強(qiáng)試驗(yàn)Ⅰ號(hào)1+、Ⅱ號(hào)-、Ⅲ號(hào)1+,該孕婦自身對(duì)照陰性。從以上試驗(yàn)初步判斷該胚胎移植孕婦血清中存在IgG不規(guī)則抗體,排除IgM抗體的存在，通過(guò)國(guó)產(chǎn)抗體篩查細(xì)胞譜比對(duì)Ⅰ、Ⅲ號(hào)陽(yáng)性的細(xì)胞格局，發(fā)現(xiàn)可能存在的不規(guī)則抗體有抗-E、抗-c、抗-JKa、抗-M。見(jiàn)表1。

2.3不規(guī)則抗體特異性鑒定試驗(yàn)

2.3.1選用十系國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20180914)進(jìn)行抗體鑒定。 根據(jù)十系國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞分析，該孕婦疑似抗-E格局，但10號(hào)細(xì)胞陽(yáng)性，則懷疑有混合抗體的存在。見(jiàn)表2。

表1 孕婦血清與篩選細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果

注：IAT為間接抗人球蛋白試驗(yàn)；聚凝胺為聚凝胺抗體篩查；IS：立即離心；2S:2次離心；+表示極小的細(xì)胞凝集混合眾多游離紅細(xì)胞；0表示陰性；1+、2+表示凝集強(qiáng)度。

表2 孕婦血清與十系國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞反應(yīng)格局

注：IAT為間接抗人球試驗(yàn)；+表示極小的細(xì)胞凝集混合眾多游離紅細(xì)胞；0表示陰性；/表示未檢測(cè)；2+表示凝集強(qiáng)度。

2.3.2考慮到混合抗體存在，進(jìn)一步換用十六系進(jìn)口Sanquin譜細(xì)胞再次鑒定。見(jiàn)表3。

2.3.3通過(guò)比對(duì)十六系進(jìn)口Sanquin譜細(xì)胞格局，符合抗-E格局。但十系國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞10號(hào)細(xì)胞陽(yáng)性，考慮有其他抗體干擾，發(fā)現(xiàn)Mur抗原只有10號(hào)細(xì)胞陽(yáng)性，且十六系進(jìn)口Sanquin譜細(xì)胞格局不含Mur抗原檢測(cè)，見(jiàn)表2。其余1～9號(hào)細(xì)胞均陰性，孕婦血清有抗-Mur的存在，為了驗(yàn)證抗-Mur的存在，筆者用二步酶法，在試管中取每組一份譜細(xì)胞與一份木瓜酶工作液37 ℃孵育適合時(shí)間，鹽水洗滌3次，配成0.8%～1.0%紅細(xì)胞懸液，50 μL酶處理細(xì)胞加50 μL受血者血清37 ℃孵育后離心，發(fā)現(xiàn)此次譜細(xì)胞格局完全符合抗-E格局，國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞10號(hào)細(xì)胞陰性，見(jiàn)表3。因木瓜酶能夠破壞MNS血型系統(tǒng)抗原，故考慮是1例抗-E合并抗-Mur。對(duì)該標(biāo)本進(jìn)行Rh分型為CCDee。

2.3.4因聯(lián)合抗體常見(jiàn)于Rh系統(tǒng)，如-Ec、-Ce等，故為了排除抗-c的存在，選取十六系進(jìn)口Sanquin譜細(xì)胞2號(hào)細(xì)胞c、E抗原陰性(陰性對(duì)照)，7和8號(hào)細(xì)胞為c抗原陽(yáng)性、E抗原陰性的譜細(xì)胞，做聚凝胺試驗(yàn)驗(yàn)證是否存在抗-c，結(jié)果試驗(yàn)均陰性，故排除抗-c存在。見(jiàn)表4。

表3 孕婦血清與十系國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞反應(yīng)格局

注：+表示極小的細(xì)胞凝集混合眾多游離紅細(xì)胞；0表示陰性；/表示未檢測(cè)；2+表示凝集強(qiáng)度。

表4 孕婦血清與十六系進(jìn)口Sanquin譜細(xì)胞反應(yīng)格局

注：PS為孕婦血清，卡為強(qiáng)生抗人球卡；+表示極小的細(xì)胞凝集混合眾多游離紅細(xì)胞；0表示陰性；/表示未檢測(cè)；2+、3+表示凝集強(qiáng)度；s表示稍強(qiáng)。

2.4不規(guī)則抗體效價(jià)測(cè)定 胚胎移植孕婦血清倍比稀釋測(cè) IgG抗-E，效價(jià)為 1,檢測(cè) IgG抗-Mur效價(jià)為1。

2.5抗體鑒定最終報(bào)告 胚胎移植孕婦血清中存在IgG抗-E合并IgG抗-Mur，效價(jià)均為1。

3 討 論

紅細(xì)胞不規(guī)則抗體中，Rh血型系統(tǒng)抗體均由免疫刺激產(chǎn)生,而Rh血型系統(tǒng)抗-E則是近年來(lái)在中國(guó)患者人群中最常檢出的抗體[5-7]，可能與中國(guó)人群RhE抗原陰性、陽(yáng)性分布接近及未實(shí)現(xiàn)RhE的同型輸注有關(guān)[8-9]。母親血型抗體引起的新生兒溶血癥及輸血的安全性，均以血型抗體為核心。對(duì)于中國(guó)患者而言，鑒于不規(guī)則抗-E的多發(fā)性，應(yīng)同白種人預(yù)防抗-D類(lèi)似，做到在輸血前對(duì)患者和獻(xiàn)血者常規(guī)檢測(cè)RhE抗原，對(duì)二者RhE抗原準(zhǔn)確分型，實(shí)現(xiàn)ABO、RhD和RhE的匹配性輸血，才可從源頭上降低不規(guī)則抗-E的陽(yáng)性率，并避免產(chǎn)生抗-E給患者再次輸血帶來(lái)困難。

抗-E是僅次于抗-D的Rh血型系統(tǒng)常見(jiàn)抗體,與其他抗體不同,少數(shù)抗-E為天然產(chǎn)生，大多數(shù)為輸血或妊娠等免疫產(chǎn)生?？?E在中國(guó)患者中的檢出率占不規(guī)則抗體陽(yáng)性總數(shù)的1/4以上[10]。本例胚胎移植孕婦為年輕女性，以前無(wú)妊娠史，2003年輸入懸浮紅細(xì)胞200 mL，至懷孕前再無(wú)輸血史，筆者通過(guò)血型血清學(xué)試驗(yàn)排除了天然IgM抗-E的存在；2018年7月9日當(dāng)?shù)蒯t(yī)院產(chǎn)檢，發(fā)現(xiàn)抗體篩選陽(yáng)性(但當(dāng)?shù)蒯t(yī)院未進(jìn)一步抗體鑒定),至2018年11月患者已孕37周，突然腹痛出血就診，隨后當(dāng)?shù)蒯t(yī)院發(fā)現(xiàn)孕婦仍然抗體篩查陽(yáng)性，故立即送上海血液中心鑒定抗體特異性，筆者通過(guò)多方法血型血清學(xué)試驗(yàn)鑒定出患者血漿中存在IgG抗-E合并IgG抗-Mur，效價(jià)均為1。結(jié)合上述分析，筆者認(rèn)為患者2003年輸入E抗原陽(yáng)性的血液，進(jìn)而發(fā)生初次免疫應(yīng)答，此次妊娠，孕婦除2003年輸血外，至今未輸過(guò)血，排除天然抗-E,筆者懷疑胎兒含E抗原紅細(xì)胞，通過(guò)胎母出血(2018年7月9號(hào)前)，再次刺激產(chǎn)生回憶性免疫應(yīng)答。胎母出血如下所述：因?yàn)樵谔ケP(pán)內(nèi)，胎兒的血液流入許多小的絨毛內(nèi)(包含有胎兒毛細(xì)血管的樹(shù)狀結(jié)構(gòu))。這些絨毛通過(guò)一層很薄的膜與母源性血液供應(yīng)分開(kāi)。這層薄膜相對(duì)而言也較易破裂。受精卵的植入不完全或胎盤(pán)畸形或腹部損傷(腹部區(qū)域的沖擊、下墜、行走時(shí)的強(qiáng)振動(dòng)、羊膜穿刺)都可危及胎盤(pán)膜，導(dǎo)致此處或多處絨毛或絨毛間隙破損。這便造成在孕期的胎兒細(xì)胞進(jìn)入母體循環(huán)(胎母出血)，使得母體暴露于“外來(lái)”的胎兒抗原之中。通常這種暴露發(fā)生在分娩時(shí)胎盤(pán)與子宮壁分離時(shí)。這時(shí)，破損的絨毛中含有大量的胎兒細(xì)胞此時(shí)可進(jìn)入母體循環(huán)，進(jìn)入母體循環(huán)的胎兒紅細(xì)胞可被母體的免疫系統(tǒng)識(shí)別為“外來(lái)”抗原。所以醫(yī)護(hù)人員應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)操作，避免孕婦產(chǎn)檢過(guò)程中造成誤傷。

MNS血型系統(tǒng)中的Miltenberger血型亞系統(tǒng)有10種不同的低頻率抗原，Mur抗原是其中之一。 抗-Mur引起的輸血反應(yīng)在臨床上與ABO不合的輸血反應(yīng)相似，都屬于急性溶血性輸血反應(yīng)。也有遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)以及嚴(yán)重的新生兒溶血病，當(dāng)用國(guó)產(chǎn)譜細(xì)胞檢查時(shí)意外發(fā)現(xiàn)了抗-Mur。該胚胎移植孕婦患者血清中的抗-Mur與譜細(xì)胞在鹽水介質(zhì)中無(wú)反應(yīng)，在聚凝胺和抗人球蛋白卡中有反應(yīng),提示抗-Mur性質(zhì)屬于IgG抗體。由于目前尚無(wú)商品化抗-Mur單克隆抗體，不能利用單克隆抗體篩檢到合適的血液,即便檢測(cè)到有意義的抗-Mur也只能盲配，這樣存在很大的風(fēng)險(xiǎn)，因此在臨床工作中我們應(yīng)該注意收集患者人源抗-Mur[11]。

另?yè)?jù)外文文獻(xiàn)報(bào)道，導(dǎo)致新生兒溶血的644種同種抗體主要來(lái)自Rh系統(tǒng)(93.1%)和MNS(6.0%)血型系統(tǒng)。產(chǎn)前Rh系統(tǒng)預(yù)防應(yīng)成為中國(guó)大陸地區(qū)的一項(xiàng)常規(guī)措施。對(duì)于有多次輸血史的中國(guó)患者，建議輸注C、c、E、e、Jk(a)和Jk(b)抗原匹配的血液。應(yīng)充分重視MNS系統(tǒng)，將抗-Mur納入抗體篩查范圍[12]。

同時(shí),為優(yōu)生優(yōu)育,育齡婦女還要盡量減少人工流產(chǎn)次數(shù),對(duì)于夫妻血型不合者,特別是曾有數(shù)次妊娠史或輸血史的孕婦,應(yīng)常規(guī)篩查并定期監(jiān)測(cè)其體內(nèi)存在的不規(guī)則抗體,必要時(shí)可采取血漿置換的方法降低母體血清中的抗體效價(jià)以保護(hù)胎兒安全[13]。

(志謝：在此感謝上海市血液中心血型參比實(shí)驗(yàn)室向東老師、劉曦老師指導(dǎo)！)