李曉華, 馮喆, 黃粵, 馬婷婷, 姚家成, 夏珍珍

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，微生物資源與利用湖北省工程技術(shù)研究中心/生物技術(shù)國家民委重點實驗室，武漢 430074)

水稻是我國乃至世界最重要的糧食作物之一，由子囊真菌引起的水稻稻瘟病[1]，嚴重影響著水稻等多種農(nóng)作物的產(chǎn)量[2].目前我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上多采用化學(xué)農(nóng)藥對稻瘟病進行防治，但是長時間的使用化學(xué)農(nóng)藥不僅成本高，還會對生態(tài)環(huán)境造成一定的危害[3,4]，并使稻瘟病菌產(chǎn)生一定的抗藥性[5].利用微生物及其代謝產(chǎn)物來防治稻瘟病[6]成為一種經(jīng)濟環(huán)保方法[7].

放線菌次級代謝產(chǎn)物中80%的天然活性物質(zhì)來源于鏈霉菌，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物可作為除草劑、抗菌劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等[8,9]，具有見效快、無污染、殘留時間短等優(yōu)點[10].attB位點是鏈霉菌染色體上的特異性重組位點，利用鏈霉菌噬菌體ΦC31構(gòu)建的質(zhì)粒pSET152，可通過質(zhì)粒中的attP位點與鏈霉菌染色體上的attB位點進行特異性重組[11].研究發(fā)現(xiàn)，attB/attP位點特異性重組發(fā)生交換的核心序列是5′-TT-3′[12].

本文從土壤中分離得到一株具有抗稻瘟病菌的菌株，利用瓊脂塊法測定該菌株對稻瘟病的抑菌活性，通過形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化和16S rDNA 基因序列同源性比對對ⅡW1菌株進行鑒定；同時對鏈霉菌ⅡW1菌株attB序列進行克隆，并試圖建立接合轉(zhuǎn)移的方法.

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

土壤采自湖北省神農(nóng)架地區(qū).指示菌稻瘟病菌NO-1菌株和168菌株由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室保藏.

總DNA提取試劑盒(TaKaRa)；引物合成、基因測序(武漢天一輝遠)；參考文獻[13]配制高氏Ι號培養(yǎng)基、G+Y培養(yǎng)基、菌絲體培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、LA培養(yǎng)基、2×YT培養(yǎng)基.

恒溫振蕩器(THZ-C，太倉市科教器材廠)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9162，上海齊欣)；冷凍離心機(TGL-20bR，上海安亭)；分析天平(ALC2100，北京賽多利斯)；電子天平(JA1103N，上海民橋)；PCR儀(C1000Touch，Bio-Rad)；凝膠成像儀(TEL-40，Synoptics)；凝膠成像分析儀(JS-2012，上海培清)；高壓滅菌鍋(YXQG02，山東新華區(qū)醫(yī)療器械廠)；超凈工作臺(SW-CJ-1BU，蘇州安泰).

1.2 菌株分離純化

取土壤樣本10 g于三角瓶中，加入90 mL無菌水，30 ℃，180 r·min-1，恒溫搖床震蕩培養(yǎng)2 h，分別將上述溶液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同濃度的土壤懸液，用涂布棒均勻涂布在高氏一號培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫箱倒置培養(yǎng)4 d，經(jīng)多次挑單菌純化后，收集生長良好的孢子，-20 ℃保存.

1.3 IIW1菌株抑菌活性檢測

利用瓊脂塊法[14]測定ⅡW1 菌株的抑菌活性，十字測量法測量抑菌圈直徑.

1.4 菌種鑒定

提取ⅡW1總DNA[15]，以總DNA為模板，使用16S rDNA通用引物擴增16S rDNA片段.PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min；56 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30個循環(huán).將擴增得到的16S rDNA片段測序，序列同源性比對分析，構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)進化樹.結(jié)合形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化進行鑒定[14].

1.5 ⅡW1菌株 attB 序列的PCR擴增

以ⅡW1菌株總DNA為模板，PCR反應(yīng)條件[16]為：95 ℃，5 min；56 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30個循環(huán).將擴增鏈霉菌ⅡW1的attB位點序列測定，序列同源性比對分析.

表1 PCR引物序列

1.6 ⅡW1菌株接合轉(zhuǎn)移

質(zhì)粒通過兩親接合轉(zhuǎn)移法[17,18]從大腸桿菌ET12567/pUZ8002導(dǎo)入到ⅡW1菌株，30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，觀察接合轉(zhuǎn)移子的數(shù)量.

2 結(jié)果和分析

2.1 ⅡW1菌株的分離

以稻瘟病菌NO-1菌株和168菌株為指示菌，以瓊脂塊檢測ⅡW1菌株對稻瘟病菌NO-1菌株和168菌株的抑菌活性，結(jié)果由圖1可見：ⅡW1菌株對稻瘟病菌NO-1菌株的抑菌圈平均直徑為29.7 mm，對稻瘟病菌168菌株的抑菌圈平均直徑為27.4 mm.表明ⅡW1菌株稻瘟病菌NO-1菌株和168菌株具有一定的抑菌活性.

1～8)ⅡW1菌株菌塊；9,10)瓊脂塊作為空白對照；a)稻瘟病菌NO-1菌株；b)稻瘟病菌168菌株

2.2 ⅡW1菌株的鑒定

將ⅡW1菌株接種到高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4 d，觀察到ⅡW1菌株氣生菌絲和基內(nèi)菌絲均呈灰白色.經(jīng)革蘭氏染色、甲基紅試驗等測定，發(fā)現(xiàn)ⅡW1菌株為革蘭氏陽性菌株，具有水解淀粉的能力，ⅡW1菌株甲基紅檢測為陽性.

提取ⅡW1菌株的總DNA，PCR擴增其16S rDNA片段，測序發(fā)現(xiàn)該片段長度為1385 bp.在NCBI數(shù)據(jù)庫中對ⅡW1菌株16S rDNA序列進行同源性分析顯示，ⅡW1株菌的16S rDNA序列與鏈霉菌屬菌種的16S rDNA序列具有高度的同源性.在MEGA軟件中進行多序列比對構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ⅡW1菌株與Streptomycespseudogriseolusstrain YR-37(KY753277.1)同源性相似度達到98%，初步鑒定ⅡW1株菌屬假灰色鏈霉菌，如圖2所示.

圖2 ⅡW1株菌16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹

2.3 假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的 attB 位點的克隆與分析

以假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的總DNA為模板，以一對引物attB1/attB2擴增attB位點序列，結(jié)果見圖3.

)DL2000 Maker；1)假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株attB PCR擴增產(chǎn)物

如圖3所示：獲得到一條DNA片段，大小為270 bp.測序結(jié)果表明，假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的attB位點序列長度為245 bp.

將假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的attB位點序列放入NCBI數(shù)據(jù)庫中，比對結(jié)果如圖4所示，多個小單孢菌和鏈霉菌的attB位點序列與假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的attB位點核心序列相似性較高，整個序列核心區(qū)高度保守，假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的attB位點核心序列中有發(fā)生位點特異性重組的5′-TT-3′序列，表明假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株染色體上含有attB位點.

2.4 假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株與大腸桿菌的接合轉(zhuǎn)移

為確定可用于假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株進行遺傳操作的篩選標記，檢測了ⅡW1菌株對氯霉素、卡那霉素、阿泊拉霉素和萘啶酮酸幾種抗生素的抗性水平，結(jié)果顯示：在1～30 μg·mL-1氯霉素范圍內(nèi)，ⅡW1菌株正常生長；當氯霉素濃度達到 40 μg·mL-1時，ⅡW1菌株不生長；卡那霉素、阿泊拉霉素濃度為1 μg·mL-1時，ⅡW1菌株就不能生長；濃度為40 μg·mL-1的萘啶酮酸對ⅡW1菌株的生長無影響.表明鏈霉菌ⅡW1菌株對卡那霉素、阿泊拉霉素敏感，對萘啶酮酸不敏感.

根據(jù)質(zhì)粒pSET152具有阿泊拉霉素抗性基因的特性，將供體大腸桿菌ET12567(pUZ8002)菌株與假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株菌絲體混合，涂布在平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)14 h，以阿泊拉霉素覆蓋作為抗性篩選標記覆蓋于平板上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，可得到對阿泊拉霉素具有穩(wěn)定抗性的假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的接合轉(zhuǎn)移子.以接合轉(zhuǎn)移子總DNA為模板，使用引物attL-F,attL-R擴增，結(jié)果如圖5所示，得到一段大小為353 bp的片段，以假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株原始菌株總DNA為模板，PCR擴增無法得到相同片段，則表明質(zhì)粒pSET152可以通過接合轉(zhuǎn)移整合至假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的染色體上.

圖4 假灰色鏈霉菌IIW1菌株attB位點序列比對

M)DL2000 Marker；1)假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株P(guān)CR產(chǎn)物；2)假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的接合轉(zhuǎn)移子PCR產(chǎn)物

3 討論

鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物是一類非常重要的微生物資源，在稻瘟病的生物防治方面具有很大潛力.本文從湖北省神農(nóng)架地區(qū)土壤中篩選出一株抗稻瘟病菌的ⅡW1菌株，研究表明，ⅡW1菌株對稻瘟病NO-1菌株及稻瘟病168菌株具有較強的抑菌作用，抑菌圈直徑分別為29.7 mm和27.4 mm.文獻報道S.vinaceusdrappus、S.philanthiRM-1-138、S.griseofuscus、S.hygroscopicus、Streptomycessp.339、S.flavotricini、S.sysdeneusis263[19]、S.globisporusJK-1[20]都表現(xiàn)出一定的抗稻瘟病活性.但目前具有抗稻瘟病活性的假灰色鏈霉菌尚未發(fā)現(xiàn)有文獻報道.PCR擴增得到ⅡW1菌株16S rDNA片段大小為1385 bp，對序列進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)ⅡW1菌株的16S rDNA基因與假灰色鏈霉菌的同源性在98%以上，初步鑒定ⅡW1屬于假灰色鏈霉菌.鏈霉菌ⅡW1菌株的attB位點序列長度為245 bp，對序列分析發(fā)現(xiàn)假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的attB位點中核心序列是5′-TT-3′，位點的序列比對結(jié)果表明，假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的attB位點與多個小單孢菌和鏈霉菌的attB位點同一性較高，其中與StreptomycesrimosusR7的位點同一性高達96%以上.

選用阿泊拉霉素為假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株接合轉(zhuǎn)移的抗性篩選標記，根據(jù)pSET152質(zhì)粒的特性，將假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株與大腸桿菌進行屬間接合轉(zhuǎn)移，獲得接合轉(zhuǎn)移子，該轉(zhuǎn)移子是具有阿泊拉霉素穩(wěn)定抗性的假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株.結(jié)果表明，通過接合轉(zhuǎn)移可以將質(zhì)粒pSET152整合到假灰色鏈霉菌ⅡW1菌株的染色體上.