宋發(fā)軍，甘喆，裴婷，苗莉云，趙偉瓊，張鵬*

(1 中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074；2 山西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，晉中 030619)

重樓是我國(guó)珍稀藥用植物.目前關(guān)于重樓內(nèi)生菌的研究還處于初步階段，主要集中在產(chǎn)重樓皂苷或皂苷元內(nèi)生菌的分離和篩選[1,2]，內(nèi)生菌的多樣性研究主要集中在云南[3-6]、福建[7]等地的重樓材料.而湖北地區(qū)種植重樓的內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其菌群特征研究尚無相關(guān)報(bào)道.

許多藥用植物內(nèi)生菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)以及種子萌發(fā)的作用，例如，盧玉君等[8]發(fā)現(xiàn)砂生槐根瘤內(nèi)生菌對(duì)青稞種子萌發(fā)及幼苗具有促生作用，本課題組前期發(fā)現(xiàn)一些重樓內(nèi)生細(xì)菌可以促進(jìn)冬小麥的種子萌發(fā)[9].本文通過對(duì)湖北地區(qū)種植重樓的根部?jī)?nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，并分析其多樣性，初步揭示該地區(qū)重樓根組織的內(nèi)生細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)，為深入分析不同產(chǎn)區(qū)重樓內(nèi)生菌的差異奠定基礎(chǔ)；并進(jìn)一步通過與小麥幼苗的共培養(yǎng)，篩選促生菌，為后期利用促生菌改良重樓種植技術(shù)研究提供菌種資源.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

五年生重樓材料于2018年5月采集于湖北省恩施州鶴峰縣五里鄉(xiāng)柏榔村種質(zhì)資源園.LA培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于內(nèi)生細(xì)菌的分離，1/2 PDA培養(yǎng)基用于共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn).T5 Super Mix(Colony)購(gòu)自北京擎科，2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自北京博邁德，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于南京翼飛雪.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 湖北種植重樓根中內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化

參照本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道[9]：(1)清洗根表面泥土后，無菌條件下削去外皮，稱取0.1 g，0.8%～1.0% NaClO溶液浸泡5 min，無菌水清洗5 min，75%(v/v)乙醇浸泡1 min，無菌水清洗3 min；取最后一次表面消毒后的無菌水涂布培養(yǎng)基，觀察是否有細(xì)菌長(zhǎng)出，從而確定消毒是否徹底.(2)無菌條件下將組織塊于2 mL生理鹽水中輕柔研磨成懸浮液，適當(dāng)稀釋后涂布培養(yǎng)基，28±2 ℃培養(yǎng)7 d.(3)培養(yǎng)過程中不斷挑取新長(zhǎng)出的內(nèi)生細(xì)菌至新的培養(yǎng)基，并采用劃線法純化獲得單克隆.

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA的擴(kuò)增與測(cè)序

分別將各個(gè)內(nèi)生細(xì)菌接入LB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 ～48 h.以0.5 μL培養(yǎng)物為模板，采用2×T5 Super Mix(Colony)以及27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTACGACTT-3′)引物進(jìn)行其16S rDNA序列的擴(kuò)增.以菌液為模板不能擴(kuò)增其16S rDNA序列的菌株，則采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA做模板，采用2×Taq PCR Master Mix以及27F和1492R引物進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物由武漢奧科鼎盛測(cè)序.

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析

內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA測(cè)序結(jié)果，上傳于NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定內(nèi)生菌的分類，并運(yùn)用MEGA 7.0軟件[10]，選用鄰接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.4 促生菌的篩選

(1)取5 μL內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)物涂布在50 mL 1/2 PDA培養(yǎng)基(350 mL組培瓶).(2)接入表面消毒處理的小麥(濟(jì)麥22)種子5粒，共5個(gè)重復(fù)，并于人工氣候培養(yǎng)箱中，28 ℃、39%濕度、4000 lux光照強(qiáng)度、14 h光照/10 h黑暗的光周期培養(yǎng)7 d；空白對(duì)照不接內(nèi)生細(xì)菌.(3)通過檢測(cè)小麥幼苗的存活情況以及根長(zhǎng)、株高、鮮重、側(cè)根數(shù)目(均為15株的平均值)篩選促生菌.

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離

采集湖北恩施州地區(qū)種植的重樓根并進(jìn)行表面消毒，將表面消毒處理的最后一步溶液涂布在培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長(zhǎng)，說明重樓根的表面消毒徹底，后期實(shí)驗(yàn)所分離的菌株為內(nèi)生細(xì)菌而不是來源于重樓根表面.本研究將0.1 g重樓根組織懸浮液，涂布于2種細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離，最終共獲得115株內(nèi)生細(xì)菌的單克隆.

2.2 內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析

分別擴(kuò)增各個(gè)內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列并測(cè)序，根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究分離的115株內(nèi)生細(xì)菌(表1，圖1)歸屬到3個(gè)門(變形桿菌門、放線菌門、厚壁菌門)，其中變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢(shì)門(67.86%)；5個(gè)綱(γ-變形桿菌綱、β-變形菌綱、α-蛋白細(xì)菌綱、放線菌綱、桿菌綱)，其中γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)為優(yōu)勢(shì)綱(66.12%)；7個(gè)目(假單胞菌目、黃色單胞菌目、腸桿菌目、伯克氏菌目、根瘤菌目、微球菌目、芽胞桿菌目)，其中黃色單胞菌目(Xanthomonadales)為優(yōu)勢(shì)目(33.9%)；11個(gè)科(假單胞菌科、黃色單胞菌科、腸桿菌科、莫氏菌科、伯克氏菌科、根瘤菌科、微桿菌科、短桿菌科、擬桿菌科、類芽孢桿菌科、芽孢桿菌科)，其中黃色單胞菌科(Xanthomonadaceae)為優(yōu)勢(shì)科(33.9%)；12個(gè)屬，其中短食單胞菌屬(Stenotrophomonas)包含39株內(nèi)生細(xì)菌，為優(yōu)勢(shì)屬(33.9%).而腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)、潘多拉菌屬(Pandoraea)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、短桿菌屬(Brevibacterium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、擬桿菌屬(Bacteroides)和波氏菌屬(Bosea)都僅包含1株內(nèi)生細(xì)菌(0.87%)，為劣勢(shì)屬.

表1 湖北地區(qū)種植重樓根組織的內(nèi)生細(xì)菌分類

圖1 湖北地區(qū)種植重樓根的內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

2.3 促生菌的篩選

從包含10株及以上內(nèi)生細(xì)菌的屬分類中隨機(jī)選擇5株，小于10株內(nèi)生細(xì)菌的屬分類中則選擇全部菌株，共計(jì)從12個(gè)屬中選擇了29株內(nèi)生細(xì)菌用于共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn).根據(jù)共培養(yǎng)7 d小麥幼苗的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)與其中17株內(nèi)生細(xì)菌共培養(yǎng)的小麥幼苗可以正常生長(zhǎng).

通過測(cè)量小麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)和鮮重，發(fā)現(xiàn)4株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用(表2)，其中HBR11015和 HBR11017菌株屬于假單胞菌屬，HBR11019菌株屬于克雷伯氏菌屬，HBR31040菌株屬于芽孢桿菌屬.HBR11019菌株的促生作用最強(qiáng)，與其共培養(yǎng)的小麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重、側(cè)根數(shù)目分別是對(duì)照的2.6倍、2.1倍、5.7倍和1.0倍，促生作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)株高和鮮重的增加(表2，圖2).與HBR31040菌株共培養(yǎng)的小麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重、側(cè)根數(shù)目分別是對(duì)照的2.4倍、1.5倍、2.6倍、1.3倍.與HBR11015菌株共培養(yǎng)的小麥幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重、側(cè)根數(shù)目分別是對(duì)照的2.1倍、1.6倍、2.0倍和1.0倍.而HBR11017菌株的主要促生作用表現(xiàn)在促進(jìn)根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)目的增加，與其共培養(yǎng)小麥幼苗的根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)目分別是對(duì)照的2.2倍和1.7倍(表2，圖2).

A)對(duì)照; B)、C)分別為與促生菌HBR11019和HBR11017共培養(yǎng)的小麥幼苗

表2 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)小麥幼苗的促生作用

注：“±”表示標(biāo)準(zhǔn)偏差,不同的字母代表不同的顯著性差異(Duncan-test,P<0.05)

3 討論

不同地理位置(種植區(qū)域)影響藥用植物的內(nèi)生菌的結(jié)構(gòu)和分布[11,12]，而內(nèi)生菌的菌群組成又影響了宿主植物的藥用物質(zhì)的合成，這是導(dǎo)致不同種植地的同一品種中藥材存在品質(zhì)差異主要原因之一.周先治等[7]發(fā)現(xiàn)福建省南平市華重樓健康植株和莖腐病感病植株的根中分別以芽孢桿菌屬和假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬.魏娟等[5]發(fā)現(xiàn)人工栽培的云南重樓根中內(nèi)生細(xì)菌以芽孢桿菌屬和腸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬.本研究從湖北地區(qū)種植的5年生重樓的0.1 g根中共分離到115株內(nèi)生細(xì)菌，短食單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)屬；其次為假單胞菌屬和芽孢桿菌屬.另外，耿紅、裴婷等[13]從云南地區(qū)種植的5年生重樓的0.1 g根中分離到228株內(nèi)生細(xì)菌，優(yōu)勢(shì)屬為假單胞菌屬和芽孢桿菌屬.這些結(jié)果說明不同地區(qū)種植的重樓根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的多樣性存在差異.本研究結(jié)果為深入分析不同產(chǎn)區(qū)重樓內(nèi)生菌的差異以及不同產(chǎn)區(qū)(地理位置)對(duì)重樓內(nèi)生菌的菌群結(jié)構(gòu)的影響提供了基礎(chǔ).

Yaish等[14]從椰棗樹幼苗的根中分離到的芽孢桿菌屬菌株具有促進(jìn)鹽脅迫下棗椰樹生長(zhǎng)和發(fā)育的作用.徐婧等[15]從土壤根際微生物中篩選到一株高產(chǎn)IAA的克雷伯氏菌，具有促進(jìn)水稻側(cè)根生長(zhǎng)作用.而本研究分離的假單胞菌屬菌株HBR11017可以促進(jìn)小麥根的伸長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)目的增加；克雷伯氏菌屬菌株HBR11019可以促進(jìn)株高和鮮重的增加，而對(duì)側(cè)根數(shù)量的促進(jìn)作用并不明顯.這表明同一屬的促生菌可能具有不同的促生效果和機(jī)理，而不同屬的菌株可能具有相同的促生效果.本研究所發(fā)現(xiàn)的促生菌，可為后期開展促生機(jī)制研究以及利用促生菌改良重樓種苗繁育技術(shù)的研究提供了菌種資源.