胡婭婷 徐志超 田亞

摘要 目的：探討不同水分條件對蒙古黃芪生長發(fā)育及次生代謝物含量的影響，為研究蒙古黃芪品質(zhì)提升及代謝調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。方法：以蒙古黃芪為試驗材料，開展大田試驗，設(shè)置常規(guī)水分條件（CK）、輕度干旱脅迫（A1）、重度干旱脅迫（A2）3個不同處理，考察了不同水分脅迫下蒙古黃芪的株高、根長、商品根長、根鮮重等性狀，并采用高效液相色譜法分析蒙古黃芪有效成分含量的變化規(guī)律。結(jié)果：輕度干旱脅迫時，黃芪株高較對照組降低7.60%、但根長提高11.23%，根鮮重提高26.07%，商品根長提高10.40%;在重度干旱脅迫下，株高、根長、商品根長、根鮮重較對照組均降低，分別為13.67%、12.60%、17.05%、5.5%;HPLC結(jié)果顯示輕度干旱脅迫下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量比對照組高11.74%;重度干旱脅迫下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量比對照組低19.93%。而在干旱脅迫下毛蕊異黃酮含量與對照組差異不大。結(jié)論：輕度干旱脅迫能夠有效促進黃芪幼苗生長并提高黃芪藥材品質(zhì)，為蒙古黃芪規(guī)范化種植技術(shù)提供參考。

關(guān)鍵詞 蒙古黃芪;干旱脅迫;生長;次生代謝物;毛蕊異黃酮;毛蕊異黃酮葡萄糖苷;品質(zhì);HPLC

Abstract Objective：To explore the effects on the growth and development and secondary metabolite content of Astragalus membranaceus var.mongholicus under under different water contents，and to lay a foundation for quality improvement of Astragalus membranaceus var.mongholicus and metabolism regulation mechanism.Methods：By using Astragalus membranaceus? var.mongholicus as the test material，the test was conducted in the field.A total of 3 different drought treatments[regular soil-water content （CK），mild drought stress （A1），and strong drought stress （A2）]were applied to investigate the plant height，root length，commercial root length，fresh root weight and other characteristics of Astragalus membranaceus var.mongholicus under above different water stress.And the High Performance Liquid Chromatography（HPLC）was used to analyze the law of change of active components in Astragalus membranaceus? var.mongholicus.Results：Under mild drought stress，the plant height of Astragalus membranaceus? var.mongholicus was significantly reduced by 7.60% compared with the control group.But the root length was significantly increased by 11.23% and the fresh root weight was significantly increased by 26.07%.The commercial root length was significantly increased by 10.40%; under severe drought stress，plant height，root length，commercial root length and root fresh weight were significantly reduced compared with the control group，which were 13.67%，12.60%，17.05% and 5.5%，respectively.HPLC results showed that，the content of Calycosin-7-glucoside was 11.74% higher than that of control group under mild drought stress，however，the content of Calycosin-7-glucoside was 19.93% lower than that of control group under severe drought stress.The content of calycosin was not significantly different from that of the control group under drought stress.Conclusion：Mild drought stress can effectively promote the growth of Astragalus membranaceus? var.mongholicus seedlings growing and improve the quality of the Radix Astragali seu Hedysari medicinal materials，so as to provide reference for the standardized planting technology of Astragalus membranaceus? var.mongholicus.

Keywords Astragalus membranaceus? var.mongholicus; Drought stress; Growth; Secondary metabolites; Calycosin-7-glucoside; Calycosin; Quality; HPLC

植物的生長往往會受到不同程度的環(huán)境脅迫。在長期的進化過程中，植物通過形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變、生理和生化上的策略調(diào)整來適應(yīng)逆境條件對植物自身帶來的不利影響[1-2]。干旱是影響植物生長、發(fā)育乃至生存的重要環(huán)境因子，通常會造成植物的各項生理指標大幅度降低，并進一步降低作物產(chǎn)量[3]。對藥用植物來說，干旱是自然界危害最大的非生物脅迫，對藥用植物的品質(zhì)、生長發(fā)育和各項生理生化指標有重要影響[4]。藥用植物的品質(zhì)由藥效活性成分的含量和外觀性狀決定，從生理生化方面已有研究證實不同程度的干旱脅迫能夠有效提高或抑制藥用植物活性成分的積累。根系是吸收水分的主要器官，對于根類藥材來講，水分是影響藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的重要環(huán)境因子。研究表明，適宜的干旱脅迫能促進根系生長，并能誘導(dǎo)次生代謝過程，提高藥效成分含量。當(dāng)水份虧缺時可嚴重影響植物生長和代謝過程，進而影響產(chǎn)量和體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累[5-6]。

黃芪是我國傳統(tǒng)補益類中藥材，本品為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.的干燥根[7]。黃芪主產(chǎn)于我國北方地區(qū)，如東北、華北、西北和內(nèi)蒙古等地區(qū)[8]。黃芪主要含黃芪皂苷類、黃酮類和多糖類等多種生物活性物質(zhì)，毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷是當(dāng)前我國黃芪質(zhì)量評價的主要參考物質(zhì)[8]?；瘜W(xué)成分決定藥用價值，現(xiàn)代藥理學(xué)研究[9-10]表明，黃芪具有提高機體免疫力、強心降壓、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種藥理功效，能促進免疫器官功能和抗體生成。黃芪不僅在臨床治療上發(fā)揮重要作用，在保健品、食品、化妝品等其他領(lǐng)域也得到廣泛使用[11-12]。當(dāng)前市場對黃芪最大需求主要體現(xiàn)在各類黃芪制劑及以黃芪為原料的各種保健品生產(chǎn)等方面，以黃芪為主的新藥研發(fā)不斷取得新突破，且野生資源遭到嚴重破壞不能滿足市場需求，只能通過大量的人工栽培黃芪滿足市場需求。干旱影響黃芪生長發(fā)育與藥材品質(zhì)，本試驗旨在研究不同程度的干旱脅迫對蒙古黃芪生長以及主要活性成分含量的影響，為黃芪規(guī)范化種植提供參考。

1 材料與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Shimadzu公司，日本，型號：LC-20A）;高通量粉粹機（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：SCIENTZ-48）;微量移液器（Eppendorf公司，型號：Eppendorf Research Plus）;臺式離心機（Sigma公司，型號：1-14）;萬分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，型號：BSA3202S];數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ5200DV）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：WGL-65B）。

1.2 試劑 色譜乙腈（Fisher Chemical公司，批號：155805），色譜甲醇（Fisher Scientific公司，批號：110939），分析純甲醇（北京化工廠，批號：20190106），娃哈哈純凈水、毛蕊異黃酮（Solarbio公司，批號：SC9010）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（Solarbio公司，批號：SM9370）。

1.3 分析樣品 2年生蒙古黃芪，由內(nèi)蒙古呼和浩特市和林格爾縣盛齊堂黃芪種植基地提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗地概況 設(shè)試驗田位于內(nèi)蒙古呼和浩特市和林格爾縣盛齊堂黃芪種植基地（40°21′N，111°56′E），海拔1 000～1 500 m。當(dāng)?shù)貙儆谥袦貛О敫珊荡箨懶约撅L(fēng)氣候，其主要特征是干旱、多風(fēng)、寒冷，日光充足，溫差大。年平均氣溫在6.2 ℃左右。1月平均氣溫為-12.8 ℃，極端氣溫為-31.7 ℃，7月平均氣溫為22.1 ℃，極端最高氣溫為37.9 ℃。歷年平均降水量為392.8 mm，1天內(nèi)降水量為99.1 mm[13]。根據(jù)實驗田土壤質(zhì)檢報告，試驗田土壤質(zhì)地為沙壤土，有良好的排灌條件，土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)：有機質(zhì)為0.40%;氮含量為25～87 mg/kg;磷為20 mg/kg;鉀為61.0 mg/kg，含量最高可達220 mg/kg;鈣為1 259.1 mg/kg;土壤的pH值檢測均為微堿性。

2.2 試驗材料處理 蒙古黃芪種子于2016年9月采收自內(nèi)蒙古呼和浩特市和林格爾縣盛齊堂黃芪種植基地。存放在通風(fēng)、陰涼、干燥的儲藏環(huán)境。蒙古黃芪種子千粒重（6.92±0.10）g，品種純度及凈度等其他指標均達到《中華人民共和國種子法》的相關(guān)要求。2017年4月下旬，對種子進行催芽，先將種子浸于50 ℃溫水中攪動，待水溫降至40 ℃后浸泡24 h，澇出洗凈用濕布覆蓋，種子膨大或種皮破裂時進行播種。5月上旬將種子拌適量細沙，均勻撒入3 cm深的播種溝內(nèi)，覆土1～1.5 cm，稍加鎮(zhèn)壓。5月下旬出苗，正常供水2個月后，選擇生長良好，大小一致的幼苗移至大棚，大棚溫度常年控制在25～28 ℃，濕度40%左右，培育1年。選擇根莖飽滿，主根長且直，生長良好，大小一致的一年生幼苗于2018年4月20日起苗移栽至大田，平壟種植，壟面寬60 cm，壟間距25 cm，每壟3行，株距27 cm，種植密度為16 500株/hm2。緩苗后于7月1日開始進行控水處理，至11月上旬黃芪地上部枯萎結(jié)束試驗。

2.3 試驗設(shè)計 試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計。共設(shè)3種水分處理，包括常規(guī)水分條件（CK：澆灌時間為正常灌溉時間的100%）、輕度干旱脅迫（A1：澆灌時間為正常灌溉時間的50%）、重度干旱脅迫（A2：雨養(yǎng)不澆水）3個不同處理，每個處理3次重復(fù)，共9個小區(qū)，小區(qū)面積為40 m2（5 m×8 m），各小區(qū)間設(shè)置1～1.5 m隔離帶。移栽前統(tǒng)一澆足底墑水，緩苗后根據(jù)試驗設(shè)計的水分處理時間開展試驗，正常灌溉處理1月1次，分別在7月中旬、8月中旬、9月中旬、10月中旬、11月中旬各澆水1次（直到土壤含水深度為30 cm左右）。每次每小區(qū)取樣3個重復(fù)，自7月起逐月取樣，共取5次。

2.4 生長量的測定 選擇生長勢良好的植株測定。分別測定5個采收時期黃芪植株的生長情況[株高、根長、商品根長（要求美觀，可用于市面上銷售）、根鮮/干重、根徑]。株高為植株基部往上到最高部位的距離，采用直尺測量;根長度為基部往下到不定根末端長度，商品根長為植株基部到根分叉部，采用直尺測量;根莖是指延長橫臥的根狀地下莖，采用游標卡尺測定;根鮮重為黃芪在自然狀態(tài)下測得的重量。

2.5 有效成分含量測定

2.5.1 色譜條件 Agilent分析柱SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流速1 mL/min;柱溫35 ℃;檢測波長254 nm;流動相：乙腈-0.3%甲酸溶液梯度洗脫。見表1。

2.5.2 對照品溶液制備 分別精密稱取毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品于10 mL容量瓶中，加甲醇配制成每毫升含毛蕊異黃酮0.136 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.175 mg的混合物對照品溶液，搖勻備用。

2.5.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細（過四號篩），精密稱取5 g，置500 mL圓底燒瓶中，精密加入分析甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷補重，過濾，濾液蒸干，殘渣加色譜甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液2、5、10、15、20、30 μL，注入液相色譜儀，以進樣量（C）橫坐標，以峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程為：A=3 142.3C+89.642，r=0.999 8;毛蕊異黃酮線性回歸方程為：A=4 536.7C+69.763，r=0.999 7。結(jié)果表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.175～3.50 μg/mL毛蕊異黃酮在0.136～2.72 μg/mL范圍內(nèi)，進樣質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.7 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)并繪圖，用 Prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用最小顯著極差法（LSD）進行差異顯著性檢驗和多重比較（P<0.01）。

2.8 樣品測定結(jié)果

2.8.1 干旱脅迫對黃芪地上部分生長的影響 黃芪株高隨株苗生長一直處于增長趨勢，緩苗后頭兩月（7～9月）株高增長最快;緩苗后到10月株高增長減緩，緩苗后至試驗結(jié)束（11月5日）株高達到最大值。見圖1。干旱脅迫后對株高產(chǎn)生顯著影響，隨著脅迫強度增大，黃芪株高隨株苗生長遞減，與常規(guī)水分條件（CK）比較，輕度干旱脅迫（A1）下株高降低了7.60%（P<0.01），重度干旱（A2）下株高降低了13.67%（P<0.05）。說明水分脅迫抑制了幼苗地上部分的生長，且干旱脅迫愈強影響愈大。

2.8.2 干旱脅迫對黃芪地下部分生長的影響 根長隨株苗的生長而增加，莖葉枯萎時達最大值;緩苗后至10月根鮮重增長迅速，以后增長緩慢，至試驗結(jié)束達到最大值。見圖1。輕度干旱脅迫后，促進了根的生長，總根長、商品根長與和根鮮重分別比對照增加11.23%（P<0.01）、10.40%（P<0.01）、26.07%（P<0.01）;重度干旱下根長比對照降低12.60%（P<0.01），根鮮重與商品根長分別顯著降低5.50%（P<0.05）和17.05%（P<0.01）。見圖1。說明輕度干旱有助于根系生長;而脅迫加重后根系的正常生長受到抑制。

2.8.3 干旱脅迫對黃芪根中2種次生代謝物含量的影響 在上述色譜條件下，分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。毛蕊異黃酮葡萄糖苷和毛蕊異黃酮的保留時間分別約為15.293、24.382 min。上述2種成分均峰形良好且與相鄰組分達到基線分離。見圖2。

通過對黃芪中毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定，發(fā)現(xiàn)輕度干旱脅迫下，不僅促進了黃芪生長發(fā)育，而且也顯著增強了毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的積累，較對照組提高11.74%（P<0.01），毛蕊異黃酮含量與對照品比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;而重度干旱脅迫下，根生長受到抑制，有效成分含量積累也會受影響，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量比對照極顯著降低19.93%（P<0.01），毛蕊異黃酮含量與對照品比較差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

3 討論

水分對植物根系的生長發(fā)育具有調(diào)控作用，尤其與根類藥材的生長和藥效成分的合成積累關(guān)系密切。在適宜水分條件下，根系生長良好，構(gòu)型合理，產(chǎn)量高，但不利于藥效成分的合成;而適度的水分脅迫能誘導(dǎo)防御與適應(yīng)反應(yīng)，促進植物生長發(fā)育，增強體內(nèi)次生代謝[2，14]，從而提高藥效成分含量。本研究發(fā)現(xiàn)，輕度干旱脅迫下黃芪株高降低，根鮮重等生長因素明顯得到提高，顯著促進了根的生長和有效成分的積累;重度干旱脅迫下顯著抑制了黃芪株高，根長，根鮮重及藥效成分積累。這與梁建萍等[6]設(shè)計的干旱脅迫對生長于盆栽中蒙古黃芪的研究結(jié)果相類似，充分證明輕度干旱脅迫不僅對植于盆栽中的植物生長具有促進作用，對移栽于大田中的植物也同樣具有促進作用。而大田更接近實際農(nóng)田復(fù)雜環(huán)境，為蒙古黃芪的大量種植提供規(guī)范化技術(shù)參考。

植物在受到水分限制時，通常會調(diào)整根系形態(tài)或分布以適應(yīng)外部干旱環(huán)境[15]，在輕度干旱條件下，黃芪為了滿足對水分的需求，將生長中心向根系轉(zhuǎn)移，試圖從土壤中吸收更多的水分，從而促進了根的生長，而地上部因受水分限制生長減弱;當(dāng)土壤干旱加重時，根系吸水受阻，影響同化物的合成[16]，因而根長、根重，根藥效成分積累顯著降低。內(nèi)蒙古自治區(qū)和林格爾縣地處我國烏蘭布和沙漠東北緣，是蒙古黃芪的道地產(chǎn)區(qū)之一，該地區(qū)氣候干旱，降水稀少，水資源短缺是阻礙該地區(qū)植物正常生長的重要因素之一，當(dāng)植被受到干旱脅迫時會產(chǎn)生很多抗逆性反應(yīng)[17]。特殊的氣候原因給蒙古黃芪的栽培種植增加了難度，如何解決此類問題是蒙古黃芪當(dāng)前面臨的重大挑戰(zhàn)。因此，研究水分與蒙古黃芪生長及藥效成分合成積累之間的關(guān)系，尋找既能提高質(zhì)量又不影響產(chǎn)量的灌溉水量，對實現(xiàn)水的高效利用以及黃芪規(guī)范化種植具有不可忽略的作用。

綜上所述，輕度干旱脅迫能促進黃芪生長及有效成分積累，但重度干旱脅迫超過了黃芪所能承受的抗逆能力，次生代謝物含量也大大降低。這一結(jié)果可為黃芪種植中藥效成分的定向培育提供水分調(diào)控理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，但本研究中毛蕊異黃酮的含量沒有得到明顯提高，證明干旱脅迫不是毛蕊異黃酮合成的的適宜環(huán)境因子，因而探討黃酮合成的適宜環(huán)境因子有待進一步研究。從生理生化方面而言，已有不少研究證實不同程度的干旱脅迫能夠有效提高或抑制藥用植物活性成分的積累，如適宜的土壤干旱有利于高山紅景天地下部分的生長及紅景天甙含量的積累[18];中度干旱脅迫可以促進菘藍根部生長和靛玉紅的積累[19]等，但具體的分子機制研究薄弱，因此將本草基因組學(xué)前沿組學(xué)技術(shù)引入中藥研究中，從分子層面更系統(tǒng)地研究藥用植物品質(zhì)與干旱脅迫之間的關(guān)系及其分子機制[20]，從根本上解決因自然干旱環(huán)境影響藥用植物生長發(fā)育與品質(zhì)的重大問題。

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（2020-02-10收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）