吳磊磊，邱玉金，王學文，趙司順

濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濰坊261000

研究顯示，機械應(yīng)力、損傷、基因突變、年齡、營養(yǎng)等影響因素均會造成椎間盤退變[1]。椎間盤作為人體最大的無血管組織，營養(yǎng)供應(yīng)缺乏，其營養(yǎng)主要是通過椎間盤纖維環(huán)途經(jīng)和軟骨終板途徑被動擴散而來[2]，而營養(yǎng)物質(zhì)的擴散必須借助于水的擴散來完成。水的跨膜轉(zhuǎn)運方式包括脂質(zhì)雙分子層的簡單擴散與通道介導的跨膜轉(zhuǎn)運，前者水擴散緩慢，而后者介導的水轉(zhuǎn)運速度快，不需要消耗能量，也不受門控機制的影響，這種通道就是水通道蛋白(AQPs)[3]。分布在人類椎間盤上的AQPs主要是AQP1和AQP3，二者共同維持椎間盤的含水量，保證椎間盤的營養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁可引起椎間盤軟骨終板的血管收縮變性，管壁肥厚，管腔狹窄，血流量減少，導致椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)減少，造成椎間盤退變。目前對于尼古丁在椎間盤退變過程中對AQPs的影響鮮有報道。我們對大鼠皮下注射尼古丁，觀察其椎間盤退變程度以及椎間盤組織中AQP1、AQP3蛋白的表達變化，探討尼古丁對椎間盤退變的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 SPF級健康雄性Wistar大鼠30只，8～9周齡，體質(zhì)量200～300 g，購于濰坊醫(yī)學院動物中心。尼古丁購于上海友思生物技術(shù)有限公司，純度為98%，加入生理鹽水稀釋為2 mg/mL的溶液，冷凍保存，注射前1 h室溫解凍。AQP1多克隆抗體、AQP3多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)、枸櫞酸鹽緩沖液、抗體稀釋液均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組與給藥方法 將大鼠隨機分為實驗1組、實驗2組及對照組各10只。實驗1組和實驗2組腹部皮下注射尼古丁稀釋液1.5 mL/(kg·d)，對照組皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)5周。

1.3 標本采集 實驗1組和對照組于注射5周后、實驗2組于注射10周后，腹腔注射10%水合氯醛處死。將大鼠置于動物手術(shù)臺上俯臥位固定，背部正中切口，顯露L4/L5椎體，取出第4、5腰椎，蒸餾水洗凈，用小尖刀及眼科剪仔細剝離L4/L5椎間盤組織。常規(guī)石蠟包埋，橫向切片。

1.4 椎間盤退變程度觀察 采用HE染色法。取石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色。加入1%鹽酸乙醇中分化10 s，自來水沖洗，1%酸性伊紅染液染色1 min。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。按照文獻[4]方法對椎間盤退變程度進行分級。1級：纖維環(huán)中纖維輕微扭曲，可以見到纖維環(huán)輕度撕裂；2級：纖維環(huán)中纖維中度扭曲，可以見到纖維環(huán)撕裂；3級：纖維環(huán)中纖維重度扭曲，可以見到纖維輕微反折畸形；4級：纖維環(huán)中纖維嚴重的反向折疊輪廓，椎間盤纖維環(huán)撕裂；5級：椎間盤纖維環(huán)撕裂，纖維環(huán)輪廓模糊不清。

1.5 椎間盤組織AQP1、AQP3表達檢測 采用SABC免疫組織化學染色法。取石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。加入0.3% H2O2消除內(nèi)源性酶活性，熱抗原修復。滴加5% BSA封閉液(山羊血清封閉液)，室溫下反應(yīng)25 min；滴加一抗(AQP1、AQP3稀釋濃度均為1∶200)，4 ℃過夜，PBS沖洗。滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育25 min，PBS沖洗。滴加試劑SABC，37 ℃孵育25 min，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素輕度復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以細胞質(zhì)呈棕黃或棕褐染色為陽性。應(yīng)用IpWin51C圖像分析系統(tǒng)測定陽性表達的光密度值，每個椎間盤隨機選取2張切片，每張切片隨機選取5個視野，取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組椎間盤退變程度比較 對照組椎間盤各組織結(jié)構(gòu)清楚，纖維環(huán)的纖維排列致密、層次分明，纖維環(huán)與髓核界限清晰、連接緊密。實驗1組椎間盤各組織結(jié)構(gòu)模糊紊亂，嚴重炎性水腫、黏液樣變性，纖維環(huán)的纖維出現(xiàn)撕裂、重度扭曲、反向折疊現(xiàn)象，局部模糊不清，纖維環(huán)與髓核連接處出現(xiàn)斷裂，60%為4級退變、35%為3級退變、5%為5級退變。實驗2組椎間盤各組織結(jié)構(gòu)模糊紊亂，層次不清，椎間盤纖維環(huán)有不同程度基質(zhì)填充，但走形仍較紊亂、扭曲。

2.2 各組髓核組織AQP1、AQP3表達水平比較 見表1。

表1 各組AQP1、AQP3表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與實驗1組比較，△P<0.05。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，吸煙可造成椎間盤退變[5]，降低脊柱疾病的治療效果。Iwahashi等[6]報道，尼古丁會造成椎間盤軟骨終板的血管芽變窄，管壁肥厚，管腔狹窄，微血管數(shù)量也明顯減少，使得局部血流量減少，氧分壓及氧飽和度明顯下降；Nasto等[5]發(fā)現(xiàn)吸煙抑制細胞DNA、蛋白多糖和膠原的合成，促進炎癥介質(zhì)的合成和釋放，加速細胞凋亡。這會嚴重干擾椎間盤營養(yǎng)的各個環(huán)節(jié)，造成椎間盤退變。Elmasry等[7]報道，吸煙會使椎間盤的營養(yǎng)血管收縮變性，椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)減少，進而黏多糖等成分合成減少，椎間盤發(fā)生退變。

髓核含水量下降是椎間盤退變的主要特征之一[8]，水分的丟失會影響椎間盤的營養(yǎng)，進而促進椎間盤的退變。AQPs作為髓核細胞水分子跨膜轉(zhuǎn)運的重要通道，在椎間盤髓核含水量的變化中具有至關(guān)重要的作用。Richardson等[9]報道，在健康人的椎間盤組織中，AQP1、AQP3在髓核和內(nèi)層纖維環(huán)中均有表達，外層纖維環(huán)中僅有少量AQP3表達，而椎間盤各結(jié)構(gòu)均未見AQP2表達。李健等[10]報道，人正常椎間盤的軟骨終板和髓核中均有AQP3表達，纖維環(huán)中無表達。表明人椎間盤中的水通道蛋白以AQP1與AQP3表達為主。本研究結(jié)果顯示，AQP1與AQP3在大鼠髓核及內(nèi)層纖維環(huán)中明顯表達。

本研究結(jié)果顯示，正常對照組與實驗1組中，AQP1與AQP3在椎間盤內(nèi)均有表達，但是在實驗1組中的髓核與內(nèi)層纖維環(huán)中AQP1、AQP3表達較正常對照組明顯減少。其原因可能與尼古丁引起炎性因子表達上調(diào)有關(guān)。尼古丁可以刺激內(nèi)皮細胞表達細胞間黏附分子-1(ICAM-1)[11]以及單核細胞分泌TNF-α[12]，這些炎性因子在椎間盤退變過程中起重要作用。曹國永等[13]對大鼠椎間盤軟骨終板細胞進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)加入尼古丁后細胞中AQP1、AQP3表達減少，并具有濃度依賴性，認為尼古丁對AQPs的表達具有明顯的抑制作用。

AQP1、AQP3是椎間盤水轉(zhuǎn)運的重要通道，AQP1、AQP3表達下降則椎間盤的水轉(zhuǎn)運障礙，進出水分減少，伴隨著水轉(zhuǎn)運而進出細胞的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運也會出現(xiàn)障礙，而營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)減少會造成細胞的功能障礙甚至凋亡；其次，水轉(zhuǎn)運功能障礙還會導致椎間盤內(nèi)代謝廢物的積聚，無法盡快運出細胞，損傷椎間盤細胞，造成椎間盤退變。此外，AQP1、AQP3表達減少還會造成對氧[14]、甘油[15]的攝取障礙，更進一步造成椎間盤的營養(yǎng)障礙。而椎間盤退變發(fā)生后，含水量減少，營養(yǎng)物質(zhì)進出細胞受阻，椎間盤細胞的功能受到影響，AQP1、AQP3表達進一步減少，從而形成惡性循環(huán)。

為了觀察去除尼古丁刺激后椎間盤的自我修復情況，本實驗對大鼠模型在尼古丁稀釋液皮下注射5周后休養(yǎng)5周;結(jié)果顯示，椎間盤組織中AQP1、AQP3表達較尼古丁注射5周時有所增多，但與正常對照組比較差距仍十分明顯。說明去除尼古丁的損傷刺激后，椎間盤營養(yǎng)及代謝的受抑制狀態(tài)逐漸解除，椎間盤細胞的功能有所恢復，AQPs合成明顯增多。但這種自主修復并不能完全逆轉(zhuǎn)椎間盤退變，而且這種修復是相當緩慢的。

綜上所述，尼古丁持續(xù)攝入會造成大鼠健康椎間盤的退變加速；AQP1、AQP3在椎間盤退變過程中具有重要作用，其表達減少或活性降低有可能是椎間盤退變的始動因素之一。