孫勤國 徐鴻婕 羅蒙 江波* 呂琨 楊倩 黃天慧 張賢梅

1．武漢大學(xué)同仁醫(yī)院(武漢市第三醫(yī)院)中醫(yī)科，湖北 武漢 430060 2．湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北 武漢 430060

糖尿病合并骨質(zhì)疏松(osteoporosis, OP)是一種全身性代謝性骨病，主要特征為骨量系統(tǒng)性減少、骨組織結(jié)構(gòu)退化，是一種代謝障礙性疾病[1-3]。糖尿病合并骨質(zhì)疏松可導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低、骨密度降低、骨脆性增加，發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加，是目前世界上發(fā)病率較高，醫(yī)療支出負(fù)擔(dān)較重的慢性疾病之一。進(jìn)入更年期的婦女，由于卵泡數(shù)量明顯減少，卵巢功能低下，從而雌激素(E2)缺失和衰老的疊加作用，使得OP在絕經(jīng)后婦女人群中的發(fā)病率相對較高[4-5]。骨是E2發(fā)揮作用的主要靶器官之一，E2缺乏導(dǎo)致骨代謝中破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的之間的相互制衡關(guān)系被打破，破骨細(xì)胞數(shù)量增加，骨吸收與骨重建的失衡，最終導(dǎo)致骨量丟失[6-9]。因此，對于糖尿病合并骨質(zhì)疏松的治療和研究迫在眉睫。

Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控成骨分化的一條重要通路，β-catenin調(diào)控細(xì)胞增殖、定向分化過程[10]。李俊峰等[11]研究認(rèn)為Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)節(jié)調(diào)控骨量上發(fā)揮重要作用。滋陰補(bǔ)腎方由生龍骨、生牡蠣、桑寄生、續(xù)斷、淫羊藿、天花粉、黃連組成。生龍骨和生牡蠣常相須為用，以治陽亢、益陰。董佳梓等[12]通過研究具有滋補(bǔ)腎陰作用桑寄生、枸杞子和桑椹對去卵巢所致大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用及其機(jī)理，桑寄生的作用是促進(jìn)OPG蛋白表達(dá)，降低IL-1含量；商學(xué)征等[13]觀察補(bǔ)腎通絡(luò)中藥(淫羊藿、黃芪、鹿角膠、生地黃、補(bǔ)骨脂、女貞子、三七、丹參、地龍)可明顯改善糖尿病骨質(zhì)疏松患者超聲骨密度，調(diào)節(jié)平衡能力。本研究以糖尿病合并去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠為對象，探索滋陰補(bǔ)腎方對其作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

50只SPF級雌性SD大鼠，3月齡，體質(zhì)量(250±14)g，購于湖北省疾病預(yù)防控制中心。飼養(yǎng)環(huán)境室溫控制在23 ℃左右，濕度60%左右，自然光源，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由飲水一周，適應(yīng)環(huán)境。將大鼠分為正常對照組、模型組、骨化三醇組、滋陰補(bǔ)腎方低劑量組、滋陰補(bǔ)腎方中劑量組、滋陰補(bǔ)腎方高劑量組。大鼠的模型建立方法：腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg，麻醉成功后，固定大鼠向上，常規(guī)消毒，無菌條件下于大鼠最末肋骨下，腋中線至脊柱外側(cè)約1 cm處備皮，切開皮膚、肌肉和腹膜，輕輕拉出脂肪團(tuán)暴露卵巢，結(jié)扎卵巢下端輸卵管，摘除雙側(cè)卵巢，止血后，逐層縫合，關(guān)腹?？p合切口，外敷消炎粉。術(shù)后正常飼養(yǎng)，切口每日消毒。進(jìn)食高糖高脂飼料。喂養(yǎng)14 d之后，禁食12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，30 mg/kg，一次性注射。造模成功后，灌胃給藥8周，每日一次。骨化三醇組灌胃骨化三醇0.1 μg/(kg.d)。滋陰補(bǔ)腎方由生龍骨30 g、生牡蠣30 g、桑寄生10 g、續(xù)斷10 g、淫羊藿10 g、天花粉10 g、黃連10 g組成；以上藥物均購于同仁醫(yī)院中藥房，經(jīng)過中藥傳統(tǒng)方法浸潤、煎煮、過濾、濃縮制成煎劑，按人與大鼠給藥換算比計(jì)算相當(dāng)生藥量5、10、20 g/(kg.d)制成低、中、高劑量。

傳統(tǒng)水輪發(fā)電機(jī)組振動(dòng)在線監(jiān)測與故障診斷系統(tǒng)基本都是采用單機(jī)式集中控制系統(tǒng)，利用變送器和傳感器將所有監(jiān)測機(jī)組的狀態(tài)參量、電量以及非電量信號收集到計(jì)算機(jī)中，并按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行計(jì)算、判斷和維修。由于該集中控制系統(tǒng)具有較多的缺陷，如果中央控制計(jì)算機(jī)一旦出現(xiàn)故障，那么整個(gè)生產(chǎn)過程就會(huì)癱瘓。

p-NF-kB兔抗，購于Abcam，貨號：ab28856；NF-kB兔抗，購于Abcam，貨號：ab16502，IkB兔抗，購于Abcam，貨號：ab7217；MyD88兔抗，購于Abcam，貨號：ab131071；GAPDH兔抗，購于Cell Signaling Technology，貨號：2118；Goat Anti-Rabbit IgG羊抗，購于Bioswamp，貨號：PAB160011。

骨組織以液氮冷凍后鋼錘砸碎，加入超聲裂解細(xì)胞，超聲裂解。4 ℃下15 000 r/min離心30 min，吸取上清液獲取總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳2.5 h，轉(zhuǎn)膜后NC膜TBS稍蕩洗，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃下分別孵育p-NF-kB(稀釋比為1∶1 000)，NF-kB(稀釋比為1∶2 000)，IkB(稀釋比為1∶2 000)，MyD88(稀釋比為1∶2 000)一抗過夜，TBST洗10 min×3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗10 min，重復(fù)3次，曝光顯影；采用 BIO-RAD Image Lab 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2 HE染色

用Trizol法提取組織總RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃變性5 min后；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，72 ℃延伸5 min。目標(biāo)基因的表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。PCR引物經(jīng)Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)，如下表1。

1.3 Western blot

2.5 m時(shí)的過流能力分別為0.442 m3/s、1.070 m3/s。 按式(1)計(jì)算得出魚道池室的容積功率耗散約為19.92 W/m3、19.29 W/m3，紊動(dòng)不劇烈，適合魚類上溯。

1.4 ELISA檢測血清中相關(guān)指標(biāo)的變化

AS屬于中醫(yī)學(xué)“脈痹”范疇，為正氣虧虛，五臟功能失調(diào)，痰瘀互結(jié)阻于脈道所致，熱毒內(nèi)蘊(yùn)是易損斑塊病機(jī)演變的重要環(huán)節(jié)。臨床治療當(dāng)隨證治之，扶正補(bǔ)虛法、活血化瘀法和清熱解毒法常聯(lián)合使用，通過調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮功能、抗血小板聚集黏附、抗血栓及抗血管平滑肌增殖等機(jī)制，以發(fā)揮中醫(yī)藥多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)治療AS的優(yōu)勢，全面干預(yù)AS的發(fā)生和發(fā)展。

1.5 RT-PCR

給藥周期結(jié)束后，斷頭處死大鼠，脫鈣后的脛骨經(jīng)過脫水，包埋于蠟塊中，以5 μm的厚度均勻切片。將蘇木精加入蒸餾水內(nèi)加溫溶解，冷卻后加入乙醇和甘油，備用。石蠟切片脫蠟至水。用Regaud蘇木精染液染核7 min。置于容器中，流水沖洗2 h。以1%的鹽酸乙醇溶液分化3 s，用伊紅染液染色5～10 min。用95%乙醇、無水乙醇、二甲苯透明、中性樹膠封固，光鏡下觀察各組大鼠脛骨骨小梁病理變化。

和正常對照組比較，模型組的p-NF-kB、NF-kB、IkB、MyD88表達(dá)水平均升高；和模型組比較，骨化三醇組，中劑量組和高劑量組的p-NF-kB、NF-kB、IkB、MyD88表達(dá)水平均降低。

表1 引物列表Table 1 Primer sequences

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

同時(shí)，寧夏圖書館設(shè)立少兒圖書分館，為青少年讀者提供了良好的閱讀環(huán)境，增加的各種圖書和繪本也吸引了更多青少年讀者。親子閱讀也將成為今后重點(diǎn)活動(dòng)之一。

2 結(jié)果

2.1 滋陰補(bǔ)腎方對脛骨形態(tài)的影響

和正常對照組比較，模型組大鼠的骨小梁排列紊亂疏松干癟，小梁寬、間距變大，骨小梁之間連接變少。滋陰補(bǔ)腎方低劑量組脛骨排列較紊亂疏松干癟，小梁間距較大，連接較少。滋陰補(bǔ)腎方中劑量組脛骨排列較疏松，整齊，小梁寬、間距變小，之間連接漸變多；滋陰補(bǔ)腎方高劑量組脛骨骨小梁排列較密集，骨小梁之間連接增多。

以ELISA的方法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10的水平。根據(jù)試劑盒的說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品、酶標(biāo)試劑及生物素標(biāo)記的抗體，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品40 μL，然后再加生物素標(biāo)記的抗體10 μL。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。

圖1 滋陰補(bǔ)腎方對脛骨形態(tài)的影響(×100)Fig.1 Effect of nourishing Yin and tonifying kidney recipe on the morphology of the tibia (×100)

2.2 滋陰補(bǔ)腎方對炎癥相關(guān)通路的影響

觀察組治療總有效率96.88%（顯效18例+有效13例）；對照組治療總有效率78.13%（顯效13例+有效12例）。兩組數(shù)據(jù)比較，觀察組治療總有效率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=5.14，P＜0.05）。

圖2 與炎癥相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)注：圖2 A為p-NF-kB、NF-kB、IkB、MyD88蛋白的表達(dá)；圖2B、圖2C、圖2D分別為Wnt-3α、LRP-5、β-catenin的表達(dá)水平；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Fig.2 Expression of inflammation-related proteins and genes

檢測Wnt-3α、LRP-5、β-catenin的mRNA表達(dá)水平見圖2。和正常對照組比較，模型組的Wnt-3α、LRP-5、β-catenin表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；和模型組比較，骨化三醇組，中劑量組和高劑量組的Wnt-3α、LRP-5、β-catenin表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。

2.3 滋陰補(bǔ)腎方對血清中相關(guān)指標(biāo)

和正常對照組比較，模型組的TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10的水平均顯著升高(P<0.05)；和模型組比較，骨化三醇組，中劑量組和高劑量組的TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10的水平均顯著降低(P<0.05)。

表2 滋陰補(bǔ)腎方對血清中相關(guān)指標(biāo)的影響Table 2 Effect of nourishing Yin and tonifying kidney recipe on the related indicators in serum

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

糖尿病合并骨質(zhì)疏松是一種全身性代謝性骨病，其主要是由于患者體內(nèi)代謝平衡被打破、骨密度降低等特點(diǎn)導(dǎo)致骨組織微結(jié)構(gòu)被破壞，骨脆性增加，從而使患者骨折風(fēng)險(xiǎn)大大增加，給患者帶來不便和困苦[14]。近年來，Wnt/β-catenin信號通路對骨代謝的影響日益受到關(guān)注。β-鏈蛋白(β-catenin)在Wnt信號通路中起到關(guān)鍵性作用[15-16]。C3H10T1/2細(xì)胞是可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞系，在BMP-2的作用下可以分化為成骨細(xì)胞[17]。Bain等[18]發(fā)現(xiàn)，BMP-2可以促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，在此過程中，在BMP-2的調(diào)控下，C3H10T1/2細(xì)胞過渡表達(dá)β-catenin，使成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物ALP表達(dá)活躍。此外，Wnt參與成骨細(xì)胞分化形成的過程。穩(wěn)定表達(dá)Wnt1/Wnt3α能促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞系的增殖，并激活標(biāo)志物ALP的活性[19]。Wnts不僅促進(jìn)了成骨細(xì)胞的生長，還能促進(jìn)成骨細(xì)胞早期分化的過程。LRP-5表達(dá)于成骨細(xì)胞的表面，對骨量的積累過程中起到重要的作用，LRP-5的功能喪失性突變可導(dǎo)致骨量減少，骨質(zhì)疏松；功能獲得性突變能夠?qū)е赂吖敲芏劝Y。它還是Wnt蛋白的跨膜蛋白，通過Wnt/LRP-5信號通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和分化，從而影響人體骨量的積累[20]。有研究證明，LRP-5的表達(dá)改變或者功能丟失，可阻止骨質(zhì)的獲得，致使體外培養(yǎng)鼠的頭蓋骨質(zhì)密度降低，骨質(zhì)厚度變薄[21-22]。本文研究了糖尿病合并去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠在滋陰補(bǔ)腎方的作用下，Wnt/β-catenin和Wnt/LRP-5信號通路的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，糖尿病合并去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠經(jīng)過滋陰補(bǔ)腎方的干預(yù)作用后，Wnt-3α、LRP-5、β-catenin的表達(dá)均升高，提示滋陰補(bǔ)腎方可通過激活Wnt/LRP-5和Wnt/β-catenin信號通路，可能增加成骨細(xì)胞的數(shù)量，增加骨量。這和滋陰補(bǔ)腎方高劑量組脛骨骨小梁排列較密集，骨小梁之間連接增多的結(jié)果相符。

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病是一種炎癥疾病。在糖尿病合并骨質(zhì)疏松的發(fā)展過程中，腎小球和腎小管的炎癥反應(yīng)為其主要的病癥之一。炎性細(xì)胞大量浸潤及細(xì)胞因子、趨化因子等炎癥反應(yīng)因子的產(chǎn)生在糖尿病的損害中發(fā)揮重要作用[23]。其中TLR-MyD88信號通路在炎癥信號的傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用。MyD88參與了糖尿病炎癥反應(yīng)和發(fā)展的全過程，它調(diào)控的下游因子NF-κB可激活多種炎癥因子(IL-6，IL-10等)的表達(dá)來發(fā)揮作用，此外，可調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)致使腎臟的纖維化。因此，TLR-MyD88信號通路是糖尿病炎癥反應(yīng)中，導(dǎo)致NF-κB活化的關(guān)鍵性通路[24-25]。糖尿病合并去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠經(jīng)過滋陰補(bǔ)腎方的干預(yù)作用后，p-NF-κB、NF-κB、IkB以及MyD88蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示滋陰補(bǔ)腎方抑制了MyD88和NF-κB的表達(dá)，可能有效抑制了其相關(guān)的炎癥通路。同時(shí)，TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10等炎癥因子的水平隨著滋陰補(bǔ)腎方的劑量而逐漸降低，提示滋陰補(bǔ)腎方對機(jī)體的糖尿病癥有所緩解，可達(dá)到增加骨密度的目的。

綜上，滋陰補(bǔ)腎方治療糖尿病合并去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠可顯著增加其成骨細(xì)胞的數(shù)量，增加骨量，可能是通過抑制NF-κB炎癥通路，并激活Wnt/β-catenin信號通路對其產(chǎn)生影響。