盧永申，魏 明

0 引言

細胞內與心腦血管以及神經信號傳遞有關的物質中，一氧化氮(NO)占有相當重要的地位[1-3]，但在機體的炎性病變過程中，高負荷的NO能夠使身體機能遭受到較大的損傷，實驗發(fā)現，當機體內積聚過多的NO時，其線粒體的功能損傷，同時，細胞自行凋亡[4-5]。在嚴重敗血癥中，過量的NO可以使細胞產生嚴重損傷[6]。誘導型的一氧化氮合酶(iNOS)能夠促進高濃度的NO產生，生成的高濃度NO可以與超氧陰離子相互作用產生過氧化亞硝基陰離子，從而使細胞中的脂類物質過度氧化、蛋白質的酪氨酸發(fā)生硝基化及巰基氧化等，進而導致體內多類炎性病變的產生[7]，所以，嚴格把控機體內NO的含量對避免NO造成的毒性傷害有至關重要的作用。STAT5通路抑制劑是一種多巴胺受體的拮抗劑，在臨床治療上多用于精神分裂癥患者。在2011年，Nelson等[8]首次提出，其作為STAT5通路的抑制劑，具有治療慢性髓系白血病的藥效?；诖耍覀兺茰ySTAT5通路抑制劑對巨噬細胞iNOS的表達也可能有調節(jié)的作用。本實驗用脂多糖(LPS)使小鼠巨噬細胞發(fā)生炎性反應，從而構建模型[9]，以STAT5通路抑制劑為工具藥物來探究STAT5通路對iNOS表達的內在調節(jié)效果。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 小鼠巨噬細胞株RAW264.7購于中國科學院細胞庫。

1.2 藥品、試劑以及主要儀器 STAT5通路抑制劑對照品以及LPS均購自Sigma公司(America)，雙抗、DMEM培養(yǎng)基以及胎牛血清購自Gibco公司(America)，總RNA提取試劑Trizol、逆轉錄試劑盒和SYBR Green qPCR Super Mix-UDG kit試劑購自大連寶生物工程公司，Griess檢測試劑盒、四甲基偶氮唑藍(MTT)、蛋白質裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質測試劑盒和羊抗兔的二抗均購自碧云天生物公司，磷酸化STAT5(p-STAT5)和總量STAT5單抗購自Bioworld公司(America)，iNOS和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗購自Cell Signaling Technology公司(America)。實時定量熒光聚合酶鏈式反應(RT-PCR)儀ABI 7500型，購自America Applied Biosystems公司,多功能酶標儀購自America Bio-Rad公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 使用帶有雙抗(100 μg/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)以及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培育RAW264.7細胞，然后將其放于5%CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱里恒溫培養(yǎng)，當其孵育到融合度達到70%～80%之后開始傳代培養(yǎng)。

1.4 MTT方法測定細胞活性 將對數生長期RAW264.7細胞按照104個/孔接種到96孔板中，細胞貼壁過夜，分別加入0、2.5、5.0、10 μmol/L的STAT5通路抑制劑反應24 h后，單孔中加入20 μl MTT液(5 mg/ml)，于37 ℃下培養(yǎng)4 h，除去板中的營養(yǎng)液，給予150 μl二甲基亞砜(DMSO)，將細胞放在搖床上搖動10 min使結晶物質完全溶解，之后用酶標儀在波長450 nm處測定光密度(OD)。

1.5 Griess方法測定細胞中NO的含量 參照文獻[9-10]將對數生長期的RAW264.7細胞用2×105個/孔的密度接種于24孔板上，細胞貼壁過夜，分別設為空白對照組、STAT5通路抑制劑(10 μmol/L)對照組(STAT5通路抑制劑對照組)、LPS誘導(LPS 1 μg/ml)組(LPS誘導組)，其中LPS誘導組分為4個亞組[1 μg/ml LPS誘導組(LPS誘導組)、1 μg/ml LPS+2.5 μmol/L STAT5通路抑制劑組(STAT5通路抑制劑組低濃度組)、1 μg/ml LPS+5 μmol/L STAT5通路抑制劑組(STAT5通路抑制劑組中濃度組)、1 μg/ml LPS+10 μmol/L STAT5通路抑制劑組(STAT5通路抑制劑組高濃度組)]，在LPS誘導前30 min使用STAT5通路抑制劑進行處理，每組設3個復孔。細胞放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定各組培養(yǎng)上清液的NO含量。按照公式計算NO抑制率。

1.6 RT-PCR檢測細胞中iNOS mRNA的表達 將對數生長期的RAW264.7細胞以1×106個/孔的密度種到6孔板里，細胞貼壁生長過夜，按照“1.5”項方法分別進行分組以及給藥。放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h之后，用Trizol方法提取細胞總量RNA，然后將提取出的RNA進行定量后用逆轉錄方法取得cDNA。用RT-PCR儀操作qPCR。由上海英濰捷基公司進行引物制作，iNOS上游的引物序列：5′-TCCATGACTCCCAGCACA-3′，下游的序列：5′-CCATCTCCTGCATTTCTTCC-3′，長度557 bp；GAPDH上游的序列：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游的序列：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，長度107 bp。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。擴增后以溶解曲線判定擴增產物的特異性效果。數據均應用相對定量的ΔΔCt方法來處理，使用iNOS mRNA/GAPDH作為評價方法，同時計算出iNOS mRNA的抑制率。

1.7 Western blot檢測細胞中iNOS、STAT5以及p-STAT5蛋白表達水平 將對數生長期的RAW264.7細胞按照“1.6”項的接種方法接種培養(yǎng)，同時按照“1.5”項方法分別進行分組以及給藥。采用蛋白提取試劑盒的方法提取每組細胞中總蛋白，用BCA蛋白定量法檢測樣品中蛋白質的量。用20～50 μg的總蛋白加入上樣緩沖液加熱至沸騰后，進行SDS-PAGE的電泳，用半干轉法把膠條中的蛋白轉移到PVDF膜上，再用5%的脫脂奶粉于25 ℃下封閉1 h，用封閉液將相對應的一抗進行稀釋，同時反應1 h，洗膜之后添加用辣根過氧化物酶標記的二抗，于25 ℃下培養(yǎng)1 h，洗膜之后用電化學發(fā)光(ECL)試劑盒進行發(fā)光操作，X片曝光成像。應用凝膠分析軟件算出壓片條帶的灰度值，以iNOS/GAPDH、p-STAT5/STAT5計算各個組蛋白質的相對表達量。

2 結果

2.1 STAT5通路抑制劑對RAW264.7細胞活性的作用 0、2.5、5.0、10 μmol/L的STAT5通路抑制劑和/或1 μg/ml LPS對RAW264.7細胞進行處理，結果發(fā)現，STAT5通路抑制劑和/或LPS均不影響細胞活性(P>0.05)，表明STAT5通路抑制劑和/或LPS對RAW264.7細胞沒有明顯的細胞毒性反應，見表1。因此，本研究以下使用的STAT5通路抑制劑對照為10 μmol/L，LPS為1 μg/ml。

2.2 STAT5通路抑制劑對RAW264.7細胞中NO產生和釋放的作用 RAW264.7細胞培養(yǎng)24 h后，空白對照組、STAT5通路抑制劑對照組、LPS誘導組以及STAT5通路抑制劑低、中、高濃度組細胞中NO的含量差異有統(tǒng)計學意義(F=25.69，P<0.05)；低、中、高濃度STAT5通路抑制劑對RAW264.7細胞中釋放NO的抑制率差異有統(tǒng)計學意義(F=132.49，P<0.05)。相較于空白對照組，LPS誘導組細胞中NO的量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LPS誘導組比較，STAT5通路抑制劑中、高濃度組細胞中NO含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖1。

表1 STAT5通路抑制劑或/和脂多糖對RAW264.7細胞活性的影響(n=3)

圖1 STAT5通路抑制劑對細胞中NO釋放量的影響

注：A.空白對照組；B.STAT5通路抑制劑對照組；C.LPS誘導組；D.STAT5通路抑制劑低濃度組；E. STAT5通路抑制劑中濃度組；F. STAT5通路抑制劑高濃度組(下同)。與空白對照組比較，#P<0.05

表2 STAT5通路抑制劑對細胞中NO釋放量的影響(n=3)

注：*與空白對照組比較;#與LPS誘導組比較

2.3 STAT5通路抑制劑對RAW264.7細胞中iNOS mRNA以及蛋白質表達的作用 RAW264.7細胞培養(yǎng)24 h后，空白對照組、STAT5通路抑制劑對照組、LPS誘導組及STAT5通路抑制劑低、中、高濃度組細胞中內iNOS mRNA以及蛋白質的表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=123.59、23.37，P<0.05)；與空白對照組比較，LPS誘導組細胞iNOS mRNA以及蛋白質的表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LPS誘導組比較，STAT5通路抑制劑中、高濃度組細胞iNOS mRNA及蛋白質的表達水平有所下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖2、圖3。

圖2 各組細胞中iNOS mRNA表達

圖3 各組細胞中iNOS蛋白表達

表3 各組細胞中iNOS mRNA以及蛋白質表達(n=3)

組別iNOS mRNA/GAPDHt值*P值*iNOS蛋白/GAPDHt值*P值*空白對照組1.00±0.001.00±0.00STAT5通路抑制劑對照組1.04±0.090.93>0.051.01±0.030.91>0.05LPS誘導組100.01±23.3489.26<0.0512.07±3.1212.54<0.05STAT5通路抑制劑低濃度組83.27±15.9868.37<0.059.15±2.018.76<0.05STAT5通路抑制劑中濃度組59.84±5.6748.76<0.058.15±1.897.28<0.05STAT5通路抑制劑高濃度組44.25±6.2933.48<0.054.26±1.295.12<0.05F值123.5932.37P值<0.05<0.05

注：*與空白對照比較

2.4 STAT5通路抑制劑對RAW264.7細胞內p-STAT5/STAT5的作用 RAW264.7細胞培養(yǎng)24 h后，空白對照組、STAT5通路抑制劑對照組、LPS誘導組以及STAT5通路抑制劑低、中、高濃度組的細胞內p-STAT5/STAT5表達差異有統(tǒng)計學意義(F=12.07，P<0.05)。與空白對照組比較，LPS誘導組細胞的p-STAT5/STAT5顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LPS誘導組比較，STAT5通路抑制劑中、高濃度組細胞的p-STAT5/STAT5明顯下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4、圖4。

圖4 各組細胞中p-STAT5/STAT5蛋白表達

表4 STAT5通路抑制劑對細胞內p-STAT5/STAT5蛋白的作用(n=3)

注：*與空白對照組比較

3 討論

應對外界的多種創(chuàng)傷性刺激，滿足機體自我防護的復雜防御過程是炎癥的本質特征。而巨噬細胞在炎癥發(fā)生發(fā)展的整個過程中都發(fā)揮了相當重要的作用。一方面通過抗原識別和遞呈激活免疫系統(tǒng)，還可以產生許多炎性物質介導大范圍的炎癥級聯過程。在炎癥的發(fā)展過程中，NO作為一種重要的炎癥因子發(fā)揮了重要作用。實驗表明，敲除相應的基因或采用藥物干預治療等方法阻礙NO的合成能夠顯著緩解患者或實驗動物的炎癥病變[11-12]。

大部分的細胞基因轉錄受到抑制是由于在轉錄因子的激活過程中一個或多個信號轉導分子被阻斷造成的[13-14]。為了探討STAT5抑制劑對RAW264.7細胞活性的影響，本實驗以2.5、5.0、10 μmol/L的STAT5抑制劑和/或1 μg/ml LPS對RAW264.7細胞進行處理，發(fā)現STAT5抑制劑和/或LPS均不影響細胞活性，表明STAT5抑制劑和/或LPS對RAW264.7細胞沒有明顯的細胞毒性反應。為判斷STAT5信號轉導通路對iNOS的表達能否產生調節(jié)效果，我們檢測了STAT5通路抑制劑對RAW264.7細胞內iNOS表達和NO釋放量的作用。本研究結果顯示，STAT5通路抑制劑在2.5～10 μmol/L的線性范圍中能夠通過調節(jié)藥物的劑量來阻礙LPS誘導的iNOS蛋白質及其mRNA的表達，以及RAW264.7細胞內NO的產生與釋放。同時也探究了STAT5通路抑制劑對p-STAT5蛋白表達的作用。研究表明，p-STAT5蛋白在受到LPS刺激3 h之后到達峰值[15]，本實驗結果提示，STAT5通路抑制劑降低了由LPS誘導的p-STAT5蛋白質的表達量，但MTT實驗數據表明，上述STAT5通路抑制劑的抑制性效果是由于其自身藥效的活性作用，并非通過細胞毒作用實現的。所以我們推測STAT5通路抑制劑降低NO的產出量可能成為其對STAT5通路抑制效果的最好解釋。

綜上，STAT5通路抑制劑能夠阻礙經LPS誘導的iNOS mRNA以及蛋白質的表達，從而降低NO的產出量。對于經NO介導的炎性病變的臨床治療，減少p-STAT5蛋白質的表達量可能是一個新的治療策略。