陳曉菲，蔡建紅，劉曉燕，任偉偉

0 引言

油用牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)屬毛茛科芍藥屬牡丹組木本植物。牡丹籽含油量20%以上；油脂中不飽和脂肪酸含量為80%～92%，其中α-亞麻酸含量為32%～67%，亞油酸含量為19%～35%[1-2]，牡丹籽油已被原國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品。隨著近幾年我國油用牡丹種植面積的急劇擴(kuò)大，油用牡丹產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，隨之產(chǎn)生了大量的牡丹籽粕。牡丹籽粕蛋白質(zhì)含量達(dá)25%，營養(yǎng)豐富[3]。因此，對(duì)牡丹籽粕蛋白進(jìn)行研究，促進(jìn)其精深加工與應(yīng)用，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和極大的營養(yǎng)保健價(jià)值[4]。

本文利用堿提酸沉提取牡丹籽蛋白質(zhì)，并對(duì)提取工藝進(jìn)行正交優(yōu)化，同時(shí)就牡丹籽蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為牡丹籽的研究與開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

牡丹籽購買于山東菏澤堯舜牡丹生物技術(shù)有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室鑒定為毛茛科芍藥屬牡丹的種子；考馬斯亮藍(lán)G250(北京索萊寶科技有限公司)；氫氧化鈉等其他試劑為分析純。WF-萬能粉碎機(jī)(江陰市康和機(jī)械制造有限公司)；紫外分光光度計(jì)UV7[梅特勒-托利多，國際貿(mào)易(上海)有限公司]；pHS-3C酸度計(jì)(上海雷磁儀器有限公司)；JY-SCZ2型雙垂直電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠)。

2 方法

2.1 提取工藝流程 牡丹籽適當(dāng)粉碎，95%乙醇脫脂，減壓過濾后晾干備用。精密稱取脫脂牡丹籽適量，加蒸餾水混勻，調(diào)節(jié)pH值至堿性，水浴加熱提取，離心，取上清，調(diào)節(jié)pH值至酸性，離心，棄上清，用蒸餾水洗滌沉淀至中性，冷凍干燥，即牡丹籽粗蛋白[4]。

2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 分別精密移取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml于試管中，補(bǔ)蒸餾水至1.0 ml，混勻，加5.0 ml考馬斯亮藍(lán)G250溶液，搖勻，靜置5 min，595 nm處測(cè)定吸光度。以蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以蛋白質(zhì)含量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過線性回歸得出方程為：Y=7.793 1 X+0.015 2，線性范圍為0～0.09 mg/ml，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。

2.3 單因素考察與正交優(yōu)化 稱取2.0 g牡丹籽干粉若干份，分別選取液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(ml/g)]、提取時(shí)間(35、40、45、50、55 min)、pH值(9.0、9.5、10、10.5、11)、提取溫度(30、35、40、45、50 ℃)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化牡丹籽蛋白的提取工藝。

2.4 牡丹籽蛋白質(zhì)理化性質(zhì)研究

2.4.1 牡丹籽蛋白質(zhì)紅外色譜 取冷凍干燥牡丹籽蛋白質(zhì)樣品適量，與干燥KBr粉末充分研磨后壓片，于4 000～400 cm-1波段掃描。

2.4.2 牡丹籽蛋白質(zhì)的分子量 目前測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量常用的技術(shù)之一為SDS-PAGE電泳，按照Laemmli法[5]進(jìn)行凝膠電泳，確定牡丹籽蛋白質(zhì)相對(duì)分子量。電泳條件為：5%濃縮膠，12%分離膠，采用200 mA電流，進(jìn)行2.5 h。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響 液料比對(duì)于牡丹籽蛋白質(zhì)的提取量具有十分關(guān)鍵的影響。液料比過大，可能造成蛋白質(zhì)的提取率降低；且其余雜質(zhì)也容易一起提取出來，從而影響蛋白質(zhì)純度，加大后續(xù)純化的難度。若液料比過小，容易出現(xiàn)蛋白質(zhì)提取不充分的情況[6]。因此,本實(shí)驗(yàn)在pH值為9、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間50 min的條件下，考察液料比對(duì)牡丹籽蛋白質(zhì)提取量的影響。如圖1所示，在料液比為10∶1～30∶1(ml/g)時(shí)，牡丹籽蛋白質(zhì)提取量隨提取溶劑體積的增加而增大，當(dāng)液料比為30∶1(ml/g)時(shí)，牡丹籽蛋白質(zhì)提取量達(dá)到最大；隨著溶劑體積繼續(xù)增加，牡丹籽蛋白質(zhì)提取量基本保持不變。

3.1.2 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響 提取時(shí)間是影響蛋白質(zhì)提取量的重要因素之一。若提取時(shí)間過短，容易出現(xiàn)蛋白質(zhì)提取不充分的情況，造成資源的浪費(fèi)。若提取時(shí)間過長，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響蛋白質(zhì)的提取率和穩(wěn)定性。因此，在pH值為9、提取溫度50 ℃、液料比30∶1(ml/g)的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)牡丹籽蛋白質(zhì)提取量的影響。如圖2所示，在35～45 min內(nèi)，蛋白質(zhì)提取量隨提取時(shí)間增加而增大，在提取時(shí)間為45 min時(shí)，提取量達(dá)到最大。當(dāng)提取時(shí)間超過45 min后，牡丹籽蛋白質(zhì)提取量逐漸降低。

圖1 液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響

圖2 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響

3.1.3 pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響 由圖3可知，在一定pH值范圍內(nèi)，牡丹籽蛋白質(zhì)提取量隨pH值升高不斷增大，當(dāng)pH值超過10.0時(shí)，蛋白質(zhì)含量下降，可能因?yàn)殡S溶液pH值的升高，改變了蛋白質(zhì)表面帶電情況。在堿性溶液中，蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷增加，影響了蛋白質(zhì)與溶劑之間或者蛋白質(zhì)分子與分子之間的相互作用，影響其溶解性[7]。

3.1.4 提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響 提取溫度是影響蛋白質(zhì)提取量的重要因素之一。若提取溫度過低，則蛋白質(zhì)提取效率較低。若提取溫度過高，致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變性，影響蛋白質(zhì)的生物活性和穩(wěn)定性[8]。因此，在pH值為9、液料比30∶1(ml/g)、提取時(shí)間50 min的條件下，考察提取溫度對(duì)牡丹籽蛋白質(zhì)提取量的影響。如圖4所示，在提取溫度為30～40 ℃，牡丹籽蛋白質(zhì)提取量隨溫度增加不斷增大，溫度超過40 ℃，蛋白質(zhì)含量降低。

圖3 pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響

圖4 提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表1～表3可知，以牡丹籽蛋白質(zhì)提取量為指標(biāo)，影響提取牡丹籽蛋白質(zhì)提取量的4個(gè)因素中，液料比影響最大，其次是提取時(shí)間、提取溫度，pH值影響最小，即C>B>D>A。牡丹籽蛋白質(zhì)提取較優(yōu)方案為A3B1C2D2，即pH值為10.5，提取40 min，液料比25∶1(ml/g)，提取溫度40 ℃。

表1 牡丹籽蛋白質(zhì)提取工藝因素水平表

3.3 牡丹籽蛋白質(zhì)理化性質(zhì)研究

3.3.1 牡丹籽蛋白質(zhì)紅外色譜分析 由圖5可知，在3 395.79 cm-1強(qiáng)而寬的吸收峰為N-H鍵的伸縮振動(dòng)，在2 933.19 cm-1處吸收峰為費(fèi)米共振，在1 655.68 cm-1處強(qiáng)吸收峰為C=O鍵的伸縮振動(dòng)，1 536.10 cm-1處為N-H彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)吸收峰，1 322.25、1 281.50、1 238.61 cm-1處為C-N和N-H彎曲振動(dòng)吸收峰，594.82 cm-1處吸收峰為C=O面外彎曲振動(dòng)吸收峰。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

注：F0.05(1,2)=19

圖5 牡丹籽蛋白質(zhì)紅外色譜圖

3.3.2 牡丹籽蛋白質(zhì)的分子量 牡丹籽蛋白質(zhì)的分子量主要集中在66.2～18.4 kDa范圍內(nèi)，主要有66.2～45.0 kDa和25.0～18.4 kDa 3條帶組成，牡丹籽蛋白質(zhì)的分子量大約為55、51、22 kDa。

見圖6。

圖6 牡丹籽蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，牡丹籽蛋白質(zhì)提取的最佳工藝條件為pH 10.5，提取40 min，液料比25∶1(ml/g)，提取溫度40 ℃，研究發(fā)現(xiàn)，牡丹籽蛋白質(zhì)的分子量主要集中在66.2～18.4 kDa，為牡丹籽蛋白質(zhì)的開發(fā)與利用提供基礎(chǔ)。