侯宜穎　劉成棟　周慧慧　麥康森　何艮

摘要：選取斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞作為體外研究模型通過(guò)蛋白質(zhì)印記分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)測(cè)定了DHA（docosahexaenoic acid二十二碳六烯酸）對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵通路以及糖脂代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)主要闡明了DHA對(duì)魚(yú)類細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝關(guān)鍵通路、糖代謝和脂代謝過(guò)程關(guān)鍵酶基因水平的影響。

關(guān)鍵詞：DHA;蛋白質(zhì);代謝;Akt/mTOR;糖脂

飼料占水產(chǎn)養(yǎng)殖總生產(chǎn)成本的一半以上而蛋白質(zhì)是影響魚(yú)類生長(zhǎng)性能和飼料成本的最重要也是最昂貴的營(yíng)養(yǎng)素[1]肉食性魚(yú)類傾向于把蛋白質(zhì)作為供能物質(zhì)而不是脂質(zhì)和碳水化合物。因此為了滿足魚(yú)類的營(yíng)養(yǎng)需求并節(jié)約成本必須要提高飼料中蛋白質(zhì)的利用效率[2]。有研究表明飼料中蛋白質(zhì)的利用效率與蛋白質(zhì)水平和非蛋白質(zhì)水平（糖和脂質(zhì)等）的可用性有關(guān)。使用非蛋白質(zhì)能源可以減少蛋白質(zhì)對(duì)生產(chǎn)力的需求并增加蛋白質(zhì)對(duì)生長(zhǎng)的利用具有節(jié)約蛋白質(zhì)的作用。

本研究中選擇斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖Ｍㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)芨酶钊氲亓私釪HA對(duì)于魚(yú)類的影響和相關(guān)機(jī)制。

1材料方法

1.1斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞的培養(yǎng)

斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞系購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心培養(yǎng)基基底配方：50% L-1535% Eagle培養(yǎng)基15% Ham's F-12。另外添加：10% 胎牛血清0.15 g/L 碳酸氫鈉15 mM HEPES0.01 mg/mL Insulin50 ng/mL bFGF2 mM GlutaMAX28 ℃無(wú)二氧化碳無(wú)菌培養(yǎng)。

1.2細(xì)胞處理

細(xì)胞處理液的配制方法在已發(fā)表的文章的基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改[6-7]在無(wú)血清培養(yǎng)基中加入1 μM BSA和500 μM DHA（Sigma#D2534）搖勻等分保存在-80 ℃下。通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基（含有1 μM BSA）將DHA儲(chǔ)備液稀釋至0、2、5、10、20、40 μM即為處理液。在六孔板中培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到90%覆蓋率將細(xì)胞用24 ℃預(yù)熱后的DPBS潤(rùn)洗兩次并用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12 h。饑餓后將細(xì)胞用處理液孵育4 h即可檢測(cè)所需指標(biāo)。

1.3蛋白質(zhì)印記分析

將處理好的細(xì)胞用DPBS洗滌兩次并用RIPA緩沖液裂解該緩沖液包含50 mM Tris150 mM NaCl0.5%NP-400.1%SDS1 mM EDTA蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物（Roche #4693132001#4906837001）。將裂解物在4 ℃下以12 000 g離心15 min。接下來(lái)用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒（Beyotime#P0011）收集上清以測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)變性后通過(guò)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至0.45 m聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene di uoride membranePVDF;Millipore#IPVH00010）。轉(zhuǎn)移后將膜用5%牛奶封閉并在一抗中于4 ℃孵育8 h以上。然后將膜用二抗孵育并用ECL試劑（Beyotime#P1008）顯影。使用的一抗如下：S6K1（CST#9202）phospho-S6K1（Thr389;CST#9205）Akt（CST#9272）phospho-Akt（Ser473;CST#9271）phospho-Akt（Thr308;CST#9275）S6（CST#2217）phospho-S6（Ser235 / 236;CST#4856）4EBP1 （CST，# 9644）phospho-4EBP1 （Thr37/46;CST，# 2855）AMPKα （CST，# 5831）phospho-AMPKα （Thr172;CST，# 50081）。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR

處理后的細(xì)胞加1 mL Trizol使其充分裂解。12 000 g4 ℃離心10 min取上清。加入1 mL氯仿冰上放置3 min。12 000 g4 ℃離心15 min取上清。加入1 mL異丙醇冰上放置10 min。4 ℃12 000 g離心10 min棄上清RNA即沉于管底。按1 mL 75%乙醇懸浮沉淀。4 ℃12 000 g離心10 min棄上清。打開(kāi)離心管的蓋子在冰上晾5～10 min干燥RNA樣品。干燥完成后加入30～60 uL DEPC水在冰上溶解RNA樣品。取2 uL樣品用核酸蛋白檢測(cè)儀（NANODROP 2000ThermoUSA）檢測(cè)RNA濃度及其O.D值。按2 μL 6×buffer + 1 μL樣品加樣并吹打混勻。在配好的瓊脂糖凝膠中點(diǎn)樣并在TAE buffer中電泳電泳槽設(shè)置180 V10 min得到三條清晰的條帶。

按照說(shuō)明使用PrimeScriptRT Reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time;TAKALAJapan）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后使用SYBR Primix Ex TaqTM（Perfect Real Time;TAKALAJapan）試劑盒進(jìn)行熒光定量反應(yīng)定量?jī)x器為Mastercycler ep realplex實(shí)時(shí)定量PCR儀（EppendorfGermany）。用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列如表1。在確定實(shí)驗(yàn)處理對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)沒(méi)有影響后計(jì)算各處理組相對(duì)于目的基因的表達(dá)量。

1.5數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）表示使用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)首先通過(guò)ANOVA （one-way analysis of variance）進(jìn)行方差分析若差異顯著再用Turkeys作多重比較。當(dāng)P<0.05時(shí)差異顯著。

2結(jié)果

2.1DHA激活斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞Akt/mTOR通路

本研究檢測(cè)了蛋白質(zhì)合成有關(guān)的信號(hào)通路中幾個(gè)關(guān)鍵激酶的活性。Akt/mTOR途徑是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的重要通路之一[8]。我們首先檢測(cè)了mTOR（target of rapamycin雷帕霉素靶蛋白）的上游激酶Akt（PKB;protein kinase B蛋白激酶B）的磷酸化水平結(jié)果表明DHA增加了phospho-AktThr308的水平。另外作為mTOR的下游靶標(biāo)phospho-4EBP1Thr37/46phospho-S6KThr389和phospho-S6Ser235/236的水平也隨著DHA濃度的增加而增加。已知4EBP1和S6磷酸化水平的增加會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯及肽鏈的延長(zhǎng)這些結(jié)果表明DHA可能通過(guò)Akt/mTOR通路促進(jìn)蛋白質(zhì)代謝（圖1;P<0.05）。

2.2DHA對(duì)斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響

本研究檢測(cè)了參與脂質(zhì)代謝的幾個(gè)關(guān)鍵酶基因結(jié)果如圖2所示DHA下調(diào)了脂質(zhì)合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因包括HMGCS（hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶）SCD（stearoyl-CoA desaturase硬脂酰輔酶A去飽和酶）SREBP-1（sterol regulatory element binding protein1固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1）和FAS（fatty acid synthetase脂肪酸合成酶）（圖2A;P<0.05）。參與脂質(zhì)分解代謝的關(guān)鍵酶基因CPT1α（carnitine palmitoyltransferase 1肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I）和ACOX（acyl CoA oxidase酰基輔酶A氧化酶）的水平下調(diào)（圖2B;P<0.05）。這些結(jié)果表明DHA處理不僅抑制斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞脂質(zhì)的合成還抑制脂質(zhì)的分解總的來(lái)說(shuō)是抑制肝臟細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝過(guò)程。

2.3DHA對(duì)斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞能量代謝的影響

蛋白質(zhì)印記分析結(jié)果顯示DHA上調(diào)了AMPK（5AMP-activated protein kinase腺苷酸激活蛋白激酶）的磷酸化水平激活了AMPK（圖3A）。我們還檢測(cè)了斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞內(nèi)的糖代謝基因和TCA循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。結(jié)果顯示DHA不僅抑制了糖酵解相關(guān)酶GCK（glucokinase葡萄糖激酶）的mRNA表達(dá)水平（圖3B;P<0.05）還抑制了參與能量代謝的關(guān)鍵酶的表達(dá)水平包括CS（citrate synthesis檸檬酸鹽合成酶）和IDH1（isocitrate dehydrogenase1異檸檬酸脫氫酶1）（圖3C;P<0.05）。結(jié)果表明DHA處理可能影響斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞能量代謝降低細(xì)胞內(nèi)能量水平。

3討論

我們的研究結(jié)果表明DHA能激活斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞內(nèi)調(diào)控蛋白質(zhì)代謝的關(guān)鍵通路—Akt/mTOR信號(hào)通路。mTOR感知營(yíng)養(yǎng)信號(hào)并通過(guò)提高其底物S6K和4EBP1的磷酸化水平促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程[9]。phospho-S6KThr389phospho-S6Ser235/236和phospho-4EBP1Thr37/46的水平隨著DHA添加水平的提高而提高說(shuō)明DHA對(duì)mTOR通路具有激活作用。這與一些臨床研究結(jié)果一致例如補(bǔ)充omega-3脂肪酸可以改善老年人的肌肉蛋白質(zhì)量并預(yù)防肌肉減少癥并且激活一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵酶的磷酸化水平例如phospho-mTORSer2448和phospho-p70S6KThr389。Akt被認(rèn)為是細(xì)胞生長(zhǎng)不可或缺的控制節(jié)點(diǎn)當(dāng)被生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)變化激活時(shí)Akt會(huì)上調(diào)mTOR信號(hào)傳導(dǎo)[10]。我們的研究結(jié)果顯示DHA上調(diào)了phospho-AktThr308水平。但是另有研究結(jié)果證明DHA處理會(huì)抑制人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453的Akt磷酸化水平認(rèn)為這些多不飽和脂肪酸暫時(shí)干擾了細(xì)胞膜的雙層結(jié)構(gòu)從而暫時(shí)破壞了細(xì)胞質(zhì)Akt向質(zhì)膜的募集或Akt與磷酸肌醇依賴激酶1（PDK1）之間的相遇[11]。然而也有研究認(rèn)為DHA作為神經(jīng)元細(xì)胞膜中含量較多的一種n-3 PUFA它通過(guò)增加細(xì)胞膜中磷脂酰絲氨酸的含量增強(qiáng)Akt的膜易位/活化[12]。不同的研究結(jié)果可能是由于實(shí)驗(yàn)材料的不同和處理時(shí)間的差異而引起的。所以關(guān)于Akt是否是DHA對(duì)mTOR作用的上游激活分子仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究檢測(cè)了斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞經(jīng)過(guò)DHA處理后參與脂質(zhì)代謝、糖代謝和能量代謝基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示DHA處理后主要的脂質(zhì)合成基因HMGCS、SCD、SREBP-1、FAS和分解基因CPT1α、ACOX的水平都被下調(diào)。結(jié)果說(shuō)明DHA處理可能抑制斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞的脂質(zhì)代謝。糖酵解不僅為細(xì)胞代謝過(guò)程提供能量還為細(xì)胞代謝提供各種代謝中間體。我們的結(jié)果顯示糖酵解基因GCK和參與能量代謝的關(guān)鍵酶（包括CS和IDH1）的水平隨著DHA濃度的增加而降低。結(jié)果證明DHA處理可能影響斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞內(nèi)的糖代謝和能量代謝。蛋白質(zhì)印記分析結(jié)果顯示phospho-AMPKThr172水平的上調(diào)也證明了這一定量結(jié)果AMPK對(duì)機(jī)體的能量平衡具有重要作用能感知機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和激素水平是細(xì)胞水平的能量感受器和調(diào)節(jié)器。一旦AMPK被激活就會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)多種消耗ATP的合成作用促進(jìn)多種合成ATP的分解作用以此平衡機(jī)體ATP平衡維持機(jī)體正常代謝所需要的能量[13]。

綜上本研究發(fā)現(xiàn)DHA處理激活斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白合成相關(guān)通路抑制斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞的脂質(zhì)合成和分解過(guò)程以及能量代謝總體來(lái)說(shuō)DHA處理可能通過(guò)改變細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝通路活性和糖代謝、脂代謝過(guò)程關(guān)鍵酶表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞的整體代謝水平這一發(fā)現(xiàn)有助于闡明脂肪酸與氨基酸協(xié)同作用對(duì)魚(yú)類營(yíng)養(yǎng)感知的影響機(jī)制從而為魚(yú)類科學(xué)高效養(yǎng)殖提供營(yíng)養(yǎng)學(xué)理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-04-23）