魏盟智　李亞軍　安鑫龍　鄧曉東

摘要：主要綜述了病毒性神經(jīng)壞死病的基本特征、診斷技術(shù)等研究進(jìn)展介紹了神經(jīng)壞死病毒的防控技術(shù)及策略簡單概述了在石斑魚養(yǎng)殖過程中病毒性神經(jīng)壞死病的防控工作。

關(guān)鍵詞：石斑魚（Epinephelus sp.）;病毒性神經(jīng)壞死病;病害防控

1我國石斑魚養(yǎng)殖和神經(jīng)壞死病發(fā)病現(xiàn)狀

石斑魚（Epinephelus sp.）是鱸形目（Perciformes）、石斑魚屬（Epinephelus）魚類的總稱為暖水性礁棲魚類。石斑魚體色色彩斑斕艷麗肉質(zhì)鮮美營養(yǎng)全面均衡同時(shí)魚肉低脂肪、高蛋白是不可多得的上等食用魚。

我國人工養(yǎng)殖石斑魚始于1980年[1]目前石斑魚養(yǎng)殖地區(qū)主要在沿海省份中的廣東、廣西、福建、浙江、海南五個(gè)省。隨著時(shí)間的推移在石斑魚養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)病毒性神經(jīng)壞死病危害嚴(yán)重最嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致養(yǎng)殖魚苗在一周內(nèi)全部死亡。

魚類病毒性神經(jīng)壞死病是由于神經(jīng)壞死病毒（ Nervous necrosis virusNNV）入侵魚體導(dǎo)致石斑魚腦、視網(wǎng)膜、魚中樞神經(jīng)等神經(jīng)系統(tǒng)壞死的病毒由該病毒引起的石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病主要發(fā)生在石斑魚的稚魚期和幼魚期。

2神經(jīng)壞死病毒

神經(jīng)壞死病毒（ Nervous necrosis virusNNV）是β諾達(dá)病毒屬（Betanodavirus）的一種[2]。于1997年Nishizawa 等人對25種Betanodavirus病毒外殼蛋白基因所包含的部分核苷酸序列的同源性進(jìn)行分析比對最終將其分為4種血清型，即tiger puffer nervous necrosis virus（TPNNV）、striped jack nervous necrosis virus（SJNNV）、red-spotted grouper nervous necrosis virus（RGNNV）和barfin flounder nervous necrosis virus（BFNNV）[3-4]。

3檢測、診斷技術(shù)

3.1表型觀察

石斑魚患該病毒癥后主要表現(xiàn)癥狀為身體發(fā)黑、腹部腫脹向上漂浮在水面、在水面狂游或呈螺旋狀游泳、厭食甚至停食、死亡。解剖病魚發(fā)現(xiàn)處于發(fā)病初期的魚脾臟鮮紅隨病情加重逐漸腫大、發(fā)黑或呈暗紅色。病魚肝臟呈土黃色或萎縮狀魚鰾有脹氣現(xiàn)象病魚腦組織顏色有變紅現(xiàn)象病魚的腎臟器官壞死、糜爛。魚體頭大而身小、形體消瘦[1]。

3.2免疫學(xué)診斷技術(shù)

利用免疫學(xué)的技術(shù)方法可以比較快速地進(jìn)行診斷如酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(yàn)（ELISA）可以利用具有專一性的抗原和抗體進(jìn)行檢測可以檢測到病魚組織內(nèi)存在的少量或微量抗原靈敏度較高但是由于某些外在因素影響往往導(dǎo)致ELISA的特異性結(jié)合不穩(wěn)定容易呈現(xiàn)出假陽性結(jié)果。目前在NNV的檢測領(lǐng)域中雖然已經(jīng)被應(yīng)用但是在逐步地被分子生物學(xué)的檢測方法取代。如Watanabe等人通過該方法對條斑星鰈親魚進(jìn)行檢測結(jié)果表明當(dāng)ELISA的抗體檢測不超過40滴度時(shí)利用該方法篩選出沒有攜帶病毒粒子的健康親魚利用經(jīng)過篩選的條斑星鰈親魚進(jìn)行繁殖其產(chǎn)生的后代仔魚基本不發(fā)病[5]。

3.3分子生物學(xué)檢測技術(shù)

利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測特別是PCR法可以有效、便捷地檢測到病毒是否存在。隨著研究層次的逐漸深入生物技術(shù)的不斷提高已經(jīng)衍生出多種多樣的PCR檢測方法。劉葒等設(shè)計(jì)出四種引物采用RT-PCR的檢測方法來鑒別出四種基因型各不相同的神經(jīng)壞死病毒[6];陳信忠等利用RT-PCR檢測技術(shù)成功地在5種養(yǎng)殖的石斑魚中擴(kuò)增出NNV RNA2條帶[7];Mu等在25%～40%的健康斜帶石斑幼魚中檢測到了NNV粒子[8];陳曉燕等利用PCR技術(shù)對斜帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒粒子的外殼蛋白基因進(jìn)行克隆和序列分析證明了該病毒株是RGNNV血清型的成員[9]。利用PCR技術(shù)檢測時(shí)可以極大地縮短技術(shù)人員的操作時(shí)間操作簡單便捷并且所得結(jié)果基本有效。其中LAMP檢測方法可以使操作過程不需要某些特定設(shè)備且時(shí)間在1～2 h內(nèi)目前這種技術(shù)已經(jīng)被普遍應(yīng)用在病毒檢疫防控領(lǐng)域[10]。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也是診斷石斑魚患病情況的技術(shù)之一它利用對病毒比較敏感的某些細(xì)胞系或者細(xì)胞株進(jìn)行人工培養(yǎng)而后進(jìn)行鑒定、分離以及確診。使用電子顯微鏡觀察切片時(shí)找到與病魚組織中含有的相同的病毒顆粒再將利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)出來的病毒顆粒對健康魚個(gè)體進(jìn)行回接感染后出現(xiàn)相同癥狀。如林楠等利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對福建漳州市石斑魚魚苗進(jìn)行病原的分離與鑒定[11];蔣方軍等利用細(xì)胞系培養(yǎng)進(jìn)行魚類神經(jīng)壞死病毒的分離[12]。但是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)難度大、耗時(shí)長不適合養(yǎng)殖基地現(xiàn)場檢測但卻是細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域非常重要的技術(shù)手段。

4病毒傳播途徑

神經(jīng)壞死病毒的傳播途徑可以分為兩種：第一種是通過親魚傳向仔魚的垂直傳播。第二種是通過水體、餌料、水草等養(yǎng)殖環(huán)境的水平傳播[2-3]。

垂直傳播是由攜帶該病毒的石斑魚產(chǎn)卵此時(shí)卵中帶有神經(jīng)壞死病毒粒子待卵孵化為仔魚時(shí)爆發(fā)病毒性神經(jīng)壞死病。篩選不攜帶病毒的健康魚體是切斷垂直傳播的主要途徑Watanabe等利用PCR技術(shù)同時(shí)結(jié)合ELISA技術(shù)對石斑魚親魚中是否含有該病毒粒子進(jìn)行檢測然后將篩選得到的不攜帶病毒粒子的親魚繁殖獲得不攜帶病毒的魚卵發(fā)現(xiàn)親魚所產(chǎn)生的后代仔魚不容易患有病毒性神經(jīng)壞死病。因此他們認(rèn)為篩選出健康不攜帶病毒粒子的親魚是切斷垂直傳播的有效手段[5]。

水平傳播是由于在養(yǎng)殖水體中有病毒粒子的存在或魚苗中有攜帶病毒粒子的個(gè)體它們釋放病毒粒子附著在水中、餌料上、水草上或直接接觸其他個(gè)體從而傳播疾病。Gomez等分離出餌料雜魚中所攜帶的NNV病毒粒子利用健康的七帶石斑魚（E.septemfasciatus） 對細(xì)胞培養(yǎng)出的NNV粒子進(jìn)行回接感染試驗(yàn)在兩周后發(fā)現(xiàn)健康石斑魚的魚腦及魚神經(jīng)中出現(xiàn)了同樣的病毒顆粒并且造成該批試驗(yàn)用魚90%以上的死亡率說明了在餌料雜魚中含有的病毒是可以感染健康魚體的[13];Manin等把兩種魚的幼魚浸泡在病魚的勻漿液中之后對全部的幼魚進(jìn)行檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部個(gè)體都含有NNV表明NNV可以利用水平傳播為其傳播途徑[14]。所以在養(yǎng)殖中需要及時(shí)對養(yǎng)殖水體進(jìn)行消毒減少密度注意水體變化。

5防治途徑

5.1物理防控

目前關(guān)于神經(jīng)壞死病的防治報(bào)道比較少能夠有效抑制病毒擴(kuò)散提高魚苗成活率的方法不多。主要需警惕該病毒的垂直傳播應(yīng)選擇健康無病親魚的后代;及時(shí)清理魚塘中的垃圾、殘餌;定時(shí)投喂益生菌等加強(qiáng)魚類免疫力;適當(dāng)降低養(yǎng)殖密度。

5.2免疫防控

疫苗免疫是目前最重要、最有效的免疫手段之一。且在海水魚病毒性疾病研究中已經(jīng)有比較多的成果。比如在赤點(diǎn)石斑魚仔魚、幼魚中通過注射疫苗的方式證明注射NNV疫苗可以使幼魚成活率提高約67%[15-16]。

朱建蕊等利用大腸桿菌表達(dá)NNV的衣殼蛋白投喂黃粉蟲并利用黃粉蟲喂養(yǎng)石斑魚從而提高了石斑魚感染NNV后的成活率[17];Lu等利用轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌表達(dá)NNV外殼蛋白從而獲得類病毒顆粒產(chǎn)生的該種病毒顆粒能在魚類神經(jīng)表面與NNV病毒粒子爭搶結(jié)合點(diǎn)這樣就極大地抑制了病毒侵入石斑魚神經(jīng)細(xì)胞使病毒入侵細(xì)胞的效率大大降低對宿主起到了很好的保護(hù)作用[18];Sommerset 等將病毒外殼蛋白重組進(jìn)行免疫發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用量為10 μg時(shí)重組蛋白具有較好免疫保護(hù)效果[19]。

然而在實(shí)際養(yǎng)殖過程中處于病毒性神經(jīng)壞死病爆發(fā)期的仔魚、幼魚的特異性免疫系統(tǒng)還沒有發(fā)育或還沒有發(fā)育成熟并不能起到特異性免疫的效果。所以關(guān)于如何有效使海水魚類產(chǎn)生免疫保護(hù)的防治技術(shù)仍需要深入研究。

6展望

自我國海水魚養(yǎng)殖業(yè)興起后病害問題一直危害著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展并且?guī)砭薮髶p失。NNV對石斑魚乃至海水魚的魚苗培育有著巨大的威脅如何解決NNV如何防控疾病是我國養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迫在眉睫、不可回避的重要課題。

加強(qiáng)免疫檢測篩選不攜帶病毒粒子的健康親魚注意水體健康切斷病毒的垂直傳播并有效抑制病毒的水平傳播才能更好地防控疾病。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙平平.石斑魚病毒性神經(jīng)性壞死病研究現(xiàn)狀[J].黑龍江水產(chǎn)，2011（05）：44-46.

[2] Nakai TMori KSugaya T，et al. Current knowledge on Viral nervous necrosis （VNN） and its causative betanodaviruses[J].Isr J Aquacult-Bamid，2009，61 （3）：198-207.

[3] 陳信忠. 石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病研究[D].廈門大學(xué)，2006.

[4] Nishizawa T，F(xiàn)uruhashi M，Nagai T，et al. Genomic classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene[J].Applied and Environmental Microbiology，1997，63（4）：1633-1636.

[5] Watanabe K，Nishizawa T，Yoshimizu M，et al.Selection of broodstock candidates of barfin flounder using an ELISA system with recombinant protein of barfin flounder nervous necrosis virus[J].Dis Aquat Organ，2000，41（3）：219-223.

[6] 劉葒，史秀杰，高隆英，等.魚病毒性神經(jīng)壞死病病毒（VNNV）不同基因型鑒別方法的建立及在VNN檢疫和監(jiān)測中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2004（06）：695-702.

[7] 陳信忠，蘇亞玲，龔艷清，等.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測5種養(yǎng)殖石斑魚的神經(jīng)壞死病毒[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2004（03）：202-207.

[8] Mu Y，Lin K，Chen X，et al. Diagnosis of nervous necrosis virus in orange-spotted grouper，Epinephelus coioides，by a rapid and convenient RT-PCR? method[J].Acta Oceanol Sin，2013，32（10）：88-92

[9] 陳曉艷，黃劍南，呂玲，等.斜帶石斑神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白基因克隆與序列分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2004（02）：183-188.

[10] 黃文，陳償，趙哲，等.海水養(yǎng)殖魚類病毒性神經(jīng)壞死病防控技術(shù)研究進(jìn)展[J].漁業(yè)研究，2016，38（05）：419-426.

[11] 林楠，吳斌，李苗苗，等.石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病的病原分離和鑒定[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，48（04）：474-479.

[12] 蔣方軍. 魚類神經(jīng)壞死病毒的分離和部分特性研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[13] Gomez D，Mori K，Okinaka Y，et al.Trash fish can be a source of betanodaviruses for cultured marine fish[J].Aquaculture，2010，302（3）：158-163.

[14] Manin B，Ransangan J.Experimental evidence of horizontal transmission of betanodavirus in hatchery-produced Asian seabass，Lates calcarifer and brown-marbled grouper，Epinephelus fuscoguttatus fingerling[J].Aquaculture，2011，321 （1-2）：157-165.

[15] Yamashita H，Nakai T.The efficacy of inactivated virus vaccine against viral nervous necrosis（VNN）[J].Fish Pathol，2005，40 （1）：15-21.

[16] Pakingking R，Norwell-Brian B，Evelyn-Grace J，et al. Protective immunity against viral nervous necrosis（VNN） in brown-marbled grouper （Epinephelus fuscogutattus） following vaccination with inactivated betanodavirus[J].Fish Shellfish Immun，2010，28（4）：525-533.

[17] 朱建蕊，翟偉鋒.NNV衣殼蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)純化及其應(yīng)用[J].南方農(nóng)業(yè)，2018，12（06）：112-114.

[18] Lu M，Liu W，Lin C，et al.Infection competition against grouper nervous necrosis virus by virus-like particles produced in Escherichia coli[J].J Gen Vir- ol，2003，84（Pt6）：1577-1582.

[19] Sommerset I，Skern R，Biering E，et al. Protection against Atlantic halibut nodavirus in turbot is induced by recombinant capsid protein vaccination but not following DNA vaccination[J].Fish Shell-fish Immun，2005，18（1）：13-29.

（收稿日期：2020-05-06）