羅萬榮 易偉宏 胡廣詢

【摘要】 目的：研究不同濃度人源性抗菌肽LL-37/聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）/β-磷酸三鈣（β-TCP）復合支架對于兔骨髓間充質干細胞（rBMSCs）增殖、分化的影響。方法：制備LL-37/PLGA/β-TCP復合支架材料，按LL-37濃度分為0、1、5、10 μmol/L組，另設置空白rBMSCs培養(yǎng)基為N組，每組三個培養(yǎng)皿，細胞密度為5×105個/皿。掃描電鏡下觀察不同濃度LL-37/PLGA/β-TCP復合支架形態(tài)。采用CCK-8檢查方法檢測各組干預rBMSCs 0、24、48、72、96、120 h后rBMSCs細胞增殖活力。干預rBMSCs 24 h后，采用熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測各組成骨相關基因堿性磷酸酶（ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（BMP-1）及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）的mRNA相對表達量。干預rBMSCs 24 h后，采用ELISA檢測各組ALP、BMP-1及BMP-7的蛋白水平。每個實驗獨立重復三次。結果：LL-37/PLGA/β-TCP復合支架材料隨著LL-37濃度增加而呈現多孔、細胞吸附增多的趨勢，促進細胞貼附生長。干預24 h后，10 μmol/L組細胞增殖能力明顯高于N組（P<0.05）;隨著干預時間延長，1、5、10 μmol/L組均對rBMSCs有促進增殖作用，且呈濃度依賴作用。1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1及BMP-7的mRNA相對表達量與蛋白表達水平均高于N組（P<0.05）;1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1及BMP-7的mRNA相對表達量與蛋白表達水平均呈高表達，且呈濃度依賴。結論：LL-37/PLGA/β-TCP復合支架可以顯著促進rBMSCs增殖與分化，是一種潛在的骨組織工程支架。

【關鍵詞】 人源性抗菌肽 PLGA/β-TCP復合支架 兔骨髓間充質干細胞 堿性磷酸酶 骨形態(tài)發(fā)生蛋白

[Abstract] Objective： To investigate the effects of concentrations of human antimicrobial peptide LL-37/polylactic acid-polyglycolic acid copolymer （PLGA）/β-tricalcium phosphate （β-TCP） composite scaffolds on proliferation and differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells （rBMSCs）. Method： LL-37/PLGA/β-TCP composite scaffolds were prepared. The scaffolds were divided into 0， 1， 5， 10 μmol/L group according to the concentration of LL-37. In addition， the blank rBMSCs medium was set as group N， three plates in each group and cell density of 5×105/plates. The morphology of LL-37/PLGA/β-TCP composite scaffolds with different concentrations were observed under scanning electron microscope. The proliferation activity of rBMSCs was detected by CCK-8 after 0， 24， 48， 72， 96 and 120 h of rBMSCs intervention. After 24 h of rBMSCs intervention， the relative mRNA expression of osteogenesis-related genes alkaline phosphatase （ALP）， bone morphogenetic protein-1 （BMP-1） and bone morphogenetic protein-7 （BMP-7） were detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction （qPCR）. After 24 h of rBMSCs intervention， the protein levels of ALP， BMP-1 and BMP-7 were detected by ELISA. Each experiment was repeated three times independently. Result： With the increase of LL-37 concentration， LL-37/PLGA/β-TCP composite scaffolds showed a trend of porous and cell adsorption， which promoted cell adhesion and growth. After 24 h of intervention， the proliferation ability of 10 μmol/L group was significantly higher than that of N group （P<0.05）. With the extension of intervention time， the 1， 5 and 10 moL/L group all had the effect of promoting rBMSCs proliferation， and the effect was concentration dependent. The relative mRNA expression and protein expression level of ALP， BMP-1 and BMP-7 in 5， 10 μmol/L group were higher than those in N group （P<0.05）. The relative mRNA expression and protein expression level of ALP， BMP-1 and BMP-7 in 1， 5， 10 μmol/L group were all highly expressed and concentration dependent. Conclusion： The LL-37/PLGA/β-TCP composite scaffold can significantly promote rBMSCs proliferation and differentiation. It is a potential bone tissue engineering scaffold.

慢性骨髓炎、開放性骨折重度污染等一直是骨科的常見病、疑難病，尤其清創(chuàng)后常出現的大塊骨缺損和創(chuàng)面感染，更是棘手的兩大難題[1-2]。一般認為骨質缺損長度超過2 cm或骨周徑缺損超過50%即為大段骨缺損[3]。目前對于大段骨缺損的治療方式主要有牽引成骨、自體或異體植骨和組織工程技術等[1，4-5]。牽引成骨治療周期長，手術復雜，有學習曲線長、并發(fā)癥多等缺點[4-5]。自體骨移植被認為是治療骨缺損的金方法，然而此方法額外增加患者創(chuàng)傷，且骨來源不足，容易受到限制[6]。異體骨移植移植費用昂貴，存在術后感染、恢復緩慢等缺點[7]。隨著近年來骨組織工程技術的發(fā)展，因其具有創(chuàng)傷小、來源不受限制等優(yōu)點，逐漸受到大家重視[1，8]。聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）和β-磷酸三鈣（β-TCP）是一種被食品和藥物管理局批準能用于人體內的醫(yī)用材料。因其具有良好的生物安全性、生物相容性以及低毒性，不易表現出抗原性或免疫原性，已被廣泛使用[6，9]。LL-37是一種人源性抗菌肽（AMPs），廣泛存在于骨髓、睪丸、中性粒細胞、單核細胞以及多處鱗狀上皮細胞中，具有抗菌活性的堿性多肽物質，因其優(yōu)越的廣譜抗菌活性及免疫調節(jié)作用而逐漸受到臨床學者關注[10]。本研究選用PLGA/β-TCP為支架，復合不同濃度的LL-37，觀察不同濃度的LL-37/PLGA/β-TCP復合支架對兔骨髓間充質干細胞（rabbit bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs）增殖和分化的影響，為LL-37/PLGA/β-TCP復合支架作為新的骨組織工程技術材料治療骨缺損提供實驗學依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 rBMSCs購買于中國廣州賽業(yè)生物科技有限公司，PLGA/β-TCP購置于購自上海麥克林生化科技有限公司;LL-37、PBS、DMEM高糖培養(yǎng)基購買于美國sigma公司、胎牛血清（FBS）及0.25%胰蛋白酶買自于中國索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、Mix買自中國南京諾唯贊生物科技有限公司;CCK-8試劑盒買自日本Dojindo有限公司;堿性磷酸酶（ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（BMP-1）及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）ELISA試劑盒買自美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 rBMSCs的培養(yǎng)、傳代與LL-37/PLGA/β-TCP復合支架的制備 rBMSCs的培養(yǎng)、傳代：將rBMSCs放入恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜后進行換液，每2天換液1次，待其鋪滿瓶底80%～90%體積時使用0.25%胰酶消化，并以1︰3比例傳代。LL-37/PLGA/β-TCP復合支架的制備與分組：向PLGA/β-TCP支架材料中加入LL-37，配成終濃度為1 mmol/L的母液。隨后向rBMSCs培養(yǎng)基中加入不同體積的LL-37/PLGA/β-TCP復合支架母液，使最終濃度為1、5、10 μmol/L，即為1、5、10 μmol/L組。另設僅加入PLGA/β-TCP復合支架材料，LL-37濃度為0 μmol/L為0 μmol/L組與空白rBMSCs培養(yǎng)基為N組，每組細胞密度為5×105個/皿，各3個培養(yǎng)皿。所有實驗獨立重復3次。

1.2.2 掃描電鏡下觀察不同濃度LL-37/PLGA/β-TCP復合支架形態(tài) rBMSCs 孵育24 h后置于電鏡下觀察0、1、5、10 μmol/L復合支架形態(tài)。

1.2.3 CCK-8檢測各組rBMSCs增殖的情況 將rBMSCs以1×105個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL，放入培養(yǎng)箱中過夜，待細胞貼壁后同上述分組方法處理，再次將其放入恒溫培養(yǎng)箱中，孵育0、24、48、72、96、120 h后吸棄上清。PBS清洗后加入含10 μL CCK-8溶液的培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱孵育3 h后用酶標儀中檢測各孔在450 nm的吸光度。

1.2.4 qPCR檢測各組成骨相關基因堿性磷酸酶（ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（BMP-1）及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）的mRNA相對表達量 rBMSCs 孵育24 h后使用Trizol提取各組細胞中RNA，然后根據說明書逆轉錄合成cDNA，上機檢測ALP、BMP-1及BMP-7的mRNA相對表達量。選用β-Actin為對照基因，對目標檢測基因進行標準化。試驗所需引物見表1。

1.2.5 采用ELISA法檢測各組ALP、BMP-1、BMP-7的蛋白表達水平 rBMSCs 孵育24 h后分別各組收集細胞上清液，嚴格按照試劑盒說明檢測各組ALP、BMP-1、BMP-7含量。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計分析，所有實驗均獨立重復三次，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度LL-37/PLGA/β-TCP復合支架下電鏡形態(tài) LL-37/PLGA/β-TCP復合支架材料隨著LL-37濃度增加而呈現多孔、細胞吸附增多的趨勢，促進細胞貼附生長，見圖1。

2.2 各組rBMSCs增殖情況 干預24 h，0、1及5 μmol/L組rBMSCs增殖與N組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而10 μmol/L組rBMSCs增殖明顯高于N組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。干預48 h，1、5、10 μmol/L組rBMSCs增殖能力均明顯高于N組（P<0.01）;隨著干預時間延長，1、5、10 μmol/L組均對rBMSCs有促進增殖作用，且呈濃度依賴作用。見表2和圖2。

2.3 各組ALP、BMP-1、BMP-7的mRNA相對表達量比較 1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1和BMP-7的mRNA表達量均明顯高于N組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1、BMP-7的mRNA均呈高表達，且呈濃度依賴性（P<0.05）。見表3和圖3。

2.4 各組ALP、BMP-1、BMP-7的蛋白表達水平比較 1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1和BMP-7的蛋白表達水平均明顯高于N組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1、BMP-7蛋白均呈高表達，且呈濃度依賴性（P<0.05）。見表4和圖4。

3 討論

大段骨缺損一直都是骨科臨床的治療難點，隨著骨組織工程技術的進展，應用骨組織工程技術治療骨或軟骨缺損逐漸成了研究的熱點。骨組織工程具有三大關鍵要素，即種子細胞、支架材料和生長因子。骨髓間充質干細胞（BMSC）是一種在骨髓基質中具有多種分化潛能的細胞亞群，其在特定刺激下可以分化為多種細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞以及神經細胞等[11]。因其具有方便獲取、可多次傳代以及較低的排斥反應，是一種骨組織工程技術的優(yōu)選種子細胞，現已廣泛應用于骨或軟骨缺損的實驗研究及臨床[12-14]。

PLGA是一種國際公認的可降解、具有良好生物相容性的材料，被廣泛認為是骨組織良好替代支架[15-16]。然PLGA因不具備成骨誘導性且親水性差，不利于細胞的黏附和分化，因此多應用于與其他材料組成復合材料，以同時具備生物相容性、生物安全性、低毒性以及良好的與細胞黏附能力[16]。β-TCP因其化學性質及晶體結構與骨骼礦物非常相似，同時可以具備可吸收性、生物相容性，但其存在脆性大、韌性差等缺陷，限制了其在骨科方面的臨床應用[17]。通過結合PLGA與β-TCP，運用3D打印技術按質量比為4︰1的比例制備了PLGA/β-TCP支架，同時具有了多孔仿生結構、良好的生物相容性、骨導電性和生物降解性，在體外和體內的實驗中取得了良好的成骨效果[18-19]。

外源性的生長因子是骨組織工程技術治療骨缺損的過程中起到決定性作用的另一關鍵因素?？咕囊蚱渚哂袕V譜抗菌特性，同時具有免疫調節(jié)能力，對機體固有免疫及獲得性免疫均有顯著增強作用，是近年來成為研究的熱點[20-21]。有研究顯示，LL-37具有顯著的抗細菌、趨化、免疫調節(jié)及抗腫瘤等作用[10]。筆者發(fā)現目前尚未有文章報道聯合使用LL-37及PLGA/β-TCP支架對于骨缺損的治療。因此本研究以rBMSCs為種子細胞，以PLGA/β-TCP支架為支架材料，同時加入LL-37作為外源性生長因子，觀察不同濃度的LL-37/PLGA/β-TCP復合支架對于rBMSCs增殖和成骨分化的影響。結果發(fā)現證明LL-37/PLGA/β-TCP具有良好的生物相容性及細胞黏附能力，能有效促進rBMSCs增殖，促進rBMSCs成骨相關基因（ALP、BMP-1和BMP-7）高表達。

綜上所述，LL-37/PLGA/β-TCP具有良好的作為骨組織工程支架的替代材料的潛能，可有效促進rBMSCs增殖和分化。在下一步研究工作中，筆者將通過動物實驗進一步探索該復合支架在生物體內的成骨作用機理，為治療大段骨缺損骨組織工程治療實驗學依據。

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（收稿日期：2020-01-06） （本文編輯：田婧）