陳兵兵 宓曉晴 李云 謝俊霞 宋寧

[摘要] 目的 探究檸檬酸鐵胺（FAC）對SH-SY5Y多巴胺能細(xì)胞系葡萄糖腦苷脂酶（GCase）活性及其蛋白表達(dá)的影響。方法 用FAC、GCase活性抑制劑環(huán)己烯四醇環(huán)氧化物（CBE）分別或共同處理細(xì)胞48 h，應(yīng)用熒光法檢測GCase活性，免疫印跡法檢測GCase蛋白表達(dá)。結(jié)果 FAC和CBE兩種因素共處理，對GCase活性及其蛋白表達(dá)的影響不存在交互作用（P>0.05）。FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞后，GCase活性降低，蛋白表達(dá)升高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.191、4.934，P<0.05）;CBE處理SH-SY5Y細(xì)胞后，GCase活性降低，蛋白表達(dá)升高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.605、4.182，P<0.05）。結(jié)論 高鐵可降低SH-SY5Y細(xì)胞中GCase的活性，升高蛋白的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 鐵;檸檬酸鹽類;葡糖苷酰鞘氨醇酶;SH-SY5Y細(xì)胞

[中圖分類號] R338.1;R345.62 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）02-0143-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.058 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200407.0930.004.html;2020-04-07 14：57

[ABSTRACT] Objective To explore the effect of ferric ammonium citrate （FAC） on glucocerebrosidase （GCase） activity and expression in SH-SY5Y dopaminergic cells. ?Methods SH-SY5Y dopaminergic cells were treated with FAC and the GCase inhibitor conduritol B epoxide （CBE）， alone or in combination， for 48 h. Fluorometric assay was used to determine the GCase acti-vity. Western blotting was performed to determine the expression level of GCase. ?Results When FAC and CBE were used in combination to treat the SH-SY5Y cells， there was no interaction between them with regard to the effect on GCase activity and expression （P>0.05）. SH-SY5Y cells treated with FAC alone showed a significantly decreased GCase activity and a significantly increased GCase expression level compared with the control group （F=8.191，4.934，P<0.05）; SH-SY5Y cells treated with CBE alone also showed a significantly decreased GCase activity and a significantly increased GCase expression level compared with the control group （F=14.605，4.182，P<0.05）. ?Conclusion High level of iron can decrease the activity and increase the expression level of GCase in SH-SY5Y cells.

[KEY WORDS] iron; citrates; glucosylceramidase; SH-SY5Y cells

近年來遺傳基因的發(fā)現(xiàn)為家族性和散發(fā)性帕金森?。≒D）的發(fā)病機(jī)制提供新見解，有5%～10%的PD病例是遺傳因素所致[1-2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PD病人中編碼葡萄糖腦苷酯酶（GCase）的基因GBA突變率達(dá)20%，因此GBA突變是目前已知的PD和相關(guān)突觸核蛋白病發(fā)展的最常見的遺傳危險(xiǎn)因素[3-5]。GCase是一種具有497個氨基酸的膜相關(guān)性蛋白，該蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成和經(jīng)糖基化修飾后，被溶酶體膜整合蛋白-2轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中，發(fā)揮生物學(xué)功能[6]。GCase活性的降低可以導(dǎo)致葡萄糖神經(jīng)酰胺的聚積，進(jìn)而導(dǎo)致戈謝病的發(fā)生[7]。在PD中，GBA突變降低了GCase的活性，導(dǎo)致α-突觸核蛋白聚集，而聚集的α-突觸核蛋白又進(jìn)一步促進(jìn)了GCase活性的降低，形成惡性循環(huán)，造成多巴胺能神經(jīng)元的死亡，因此GCase的活性與PD的發(fā)病進(jìn)程密切相關(guān)[8-12]。鐵是PD發(fā)病的重要因素之一[13]，鐵可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和鐵死亡等[14-16]，從而造成多巴胺能神經(jīng)元的選擇性損傷。然而，目前關(guān)于鐵對GCase活性及其蛋白表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。因此，本研究應(yīng)用檸檬酸鐵銨（FAC）制備SH-SY5Y多巴胺能細(xì)胞系的高鐵模型，并使用GCase的不可逆競爭性抑制劑環(huán)己烯四醇環(huán)氧化物（CBE）作為對照藥，探討鐵對GCase活性及其蛋白表達(dá)的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SH-SY5Y細(xì)胞系由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購自以色列BI公司，4-甲基傘形酮-β-葡萄糖苷（4-MU-β-GLC）、CBE、FAC和GCase一抗購自美國Sigma公司，β-actin抗體、HRP-IgG標(biāo)記的二抗購自北京博奧森公司，ECL發(fā)光液為Millipore公司產(chǎn)品，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)前將實(shí)驗(yàn)器具高壓滅菌。從液氮中取出凍存的SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)移到37 ℃水浴中迅速（30 s內(nèi)）解凍，充分搖勻后置于離心機(jī)中，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入完全培養(yǎng)液吹打均勻后接種到25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，光鏡下觀察細(xì)胞是否貼壁，然后置于培養(yǎng)箱中（37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2）培養(yǎng)，每隔2 d傳代1次。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

將SH-SY5Y細(xì)胞分為對照組（A組）、FAC處理組（B組）、CBE處理組（C組）、FAC和CBE共處理組（D組）。將SH-SY5Y細(xì)胞以2×104/cm2的密度接種于6孔板中，每孔加入1.5 mL的細(xì)胞混懸液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到50%～70%融合時，對照組加入新鮮無血清的培養(yǎng)液;FAC處理組加入100 μmol/L的FAC;CBE處理組則加入100 μmol/L的CBE;FAC和CBE共處理組先加入100 μmol/L的CBE預(yù)孵育30 min，再加入100 μmol/L的FAC。上述各組藥物處理時間均為48 h。

1.4 GCase酶活性的測定

藥物處理48 h后每孔加入100 μL的磷酸鹽緩沖液，于冰上靜置30 min后用刮板刮下細(xì)胞并在細(xì)胞破碎儀中破碎，破碎強(qiáng)度為30%;在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min;取2.5 μL的上清，加入5 mmol/L的4-MU-β-GLC 12.5 μL，37 ℃孵育30 min后，加入1 mol/L的甘氨酸緩沖液（pH值=10）終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上設(shè)定激發(fā)光波長EX=360 nm、發(fā)射光波長Em=460 nm，檢測產(chǎn)物4-甲基傘形酮的含量，以相對熒光單位（RFU）表示，并應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒檢測提取樣品的蛋白濃度（RFU/μg總蛋白）。

1.5 免疫印跡法檢測GCase蛋白表達(dá)

藥物處理48 h后提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測提取蛋白的濃度，以每孔總蛋白量為20 μg計(jì)算蛋白上樣量，加入Loading Buffer，95 ℃煮5 min。經(jīng)120 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳后濕轉(zhuǎn)到0.45 μm 的PVDF膜上，室溫下用100 g/L的脫脂奶粉溶液封閉2 h，再分別加入GCase（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗于4 ℃搖床過夜。第2天用山羊抗兔的HRP-IgG（1∶10 000）孵育1 h后以TBST溶液洗3次，每次10 min，ECL發(fā)光液顯影后用Image J統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，針對FAC和CBE兩種處理因素，采用析因設(shè)計(jì)的方差分析進(jìn)行處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 FAC對GCase活性的影響

析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，F(xiàn)AC和CBE這兩種因素對GCase活性的影響不存在交互作用（P>0.05），因此進(jìn)一步分析FAC、CBE主效應(yīng)的結(jié)果是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。100 μmol/L FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，F(xiàn)AC處理組酶活性較對照組有明顯的下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.191，P<0.05）;在CBE處理SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，CBE處理組酶活性也較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.605，P<0.05）。見表1。

2.2 FAC對GCase蛋白表達(dá)的影響

析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，F(xiàn)AC和CBE兩種因素不存在交互作用（P>0.05），因此進(jìn)一步分析FAC、CBE主效應(yīng)是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。100 μmol/L FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，F(xiàn)AC處理組蛋白表達(dá)較對照組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.934，P<0.05）;在100 μmol/L CBE處理SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，CBE處理組與對照組比較蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.182，P<0.05）。見表1。

3 討 ?論

PD的發(fā)病機(jī)制迄今未明，研究表明遺傳因素、環(huán)境因素和老化因素均可參與PD中多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡過程[17-19]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在PD病人的黑質(zhì)（SN）中鐵的總量隨疾病嚴(yán)重程度的增加而增加[20-23]，這些過量的不穩(wěn)定性鐵可通過Fenton反應(yīng)催化產(chǎn)生具有高細(xì)胞毒性的羥自由基[14，22-25]，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而造成疾病的發(fā)生。在GBA突變的PD病人的小腦、殼核、杏仁核、SN中GCase活性降低，其中以SN最明顯。同時，在非GBA突變的散發(fā)性PD病人小腦和SN中GCase活性也明顯下降[26-27]。在6-羥基多巴胺制備的PD大鼠模型中，檢測到SN和紋狀體的GCase活性下降[28]。

本實(shí)驗(yàn)用100 μmol/L FAC、100 μmol/L CBE處理SH-SY5Y多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系，研究鐵對GCase活性及蛋白表達(dá)的影響。文獻(xiàn)報(bào)道，溶酶體內(nèi)的酶都是水解酶，而且一般最適pH值為5.0，所以都是酸性水解酶[29]。有研究表明，在鐵負(fù)載的細(xì)胞中，溶酶體pH值從5.0增加到5.7，高鐵破壞了細(xì)胞內(nèi)溶酶體的酸性環(huán)境[30]。本研究結(jié)果顯示，在FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，GCase的活性明顯降低，提示細(xì)胞內(nèi)的高鐵環(huán)境破壞了溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境，從而使GCase的活性降低。而GCase活性的降低可能代償性地引起了GCase蛋白表達(dá)的增加。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)元中加入野生型或者A53T突變的α-突觸核蛋白在降低溶酶體中GCase活性的同時增加了GCase的蛋白表達(dá)，α-突觸核蛋白可抑制GCase在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸[31]。既往有研究表明，在SH-SY5Y細(xì)胞中，F(xiàn)AC可以誘導(dǎo)α-突觸核蛋白表達(dá)升高[32-33]，CBE也可以誘導(dǎo)α-突觸核蛋白表達(dá)升高[34-36]。本實(shí)驗(yàn)加入鐵后細(xì)胞的GCase蛋白表達(dá)明顯升高，推測可能是細(xì)胞內(nèi)高鐵環(huán)境誘導(dǎo)了α-突觸核蛋白表達(dá)升高，升高的α-突觸核蛋白抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中GCase的合成，使其不能折疊成正常的構(gòu)象而無法到達(dá)高爾基體加工成熟，未加工成熟的蛋白不具備酶的活性，因此GCase蛋白的表達(dá)升高，而酶活性降低。本實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到FAC與GCase抑制劑兩者的協(xié)同作用（析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，F(xiàn)AC、CBE兩種因素之間無交互作用，因此說明FAC與CBE無協(xié)同作用）。

綜上所述，在高鐵環(huán)境下，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)GCase的活性降低，蛋白的表達(dá)升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究GCase在PD發(fā)病中的作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] BLAUWENDRAAT C， REED X， KROHN L， et al. Genetic modifiers of risk and age at onset in GBA associated Parkinsons disease and Lewy body dementia[J]. Brain，2020，143（1）：234-248.

[2] LEE A， GILBERT R M. Epidemiology of Parkinson disease[J]. Neurologic Clinics， 2016，34（4）：955-965.

[3] TOFFOLI M， SMITH L， SCHAPIRA A H. The biochemical basis of interactions between Glucocerebrosidase and alpha-synuclein in GBA1 mutation carriers[J]. Journal of Neuroche-mistry， 2020. doi：org/10.1111/jnc.14968.

[4] LUNDE K A， CHUNG J， DALEN I， et al. Association of glucocerebrosidase polymorphisms and mutations with dementia in incident Parkinsons disease[J]. Alzheimers & Dementia： the Journal of the Alzheimers Association， 2018，14（10）：1293-1301.

[5] NALLS M A， DURAN R， LOPEZ G， et al. A multicenter study of glucocerebrosidase mutations in dementia with Lewy bodies[J]. JAMA Neurology， 2013，70（6）：727-735.

[6] DO J， MCKINNEY C， SHARMA P， et al. Glucocerebrosidase and its relevance to Parkinson disease[J]. Molecular Neurodegeneration， 2019，14（1）：36-52.

[7] HRUSKA K S， LAMARCA M E， SCOTT C R， et al. Gaucher disease： mutation and polymorphism spectrum in the glucocerebrosidase gene （GBA）[J]. Human Mutation， 2008，29（5）：567-583.

[8] LERCHE S， WURSTER I， ROEBEN B， et al. Parkinsons disease： glucocerebrosidase 1 mutation severity is associated with CSF alpha-synuclein profiles[J]. Movement Disorders， 2020，35（3）：495-499.

[9] YANG S Y， GEGG M， CHAU D， et al. Glucocerebrosidase activity， cathepsin D and monomeric alpha-synuclein interactions in a stem cell derived neuronal model of a PD associated GBA1 mutation[J]. Neurobiol Dis， 2020，134：104620.

[10] BLANZ J， SAFTIG P. Parkinsons disease： acid-glucocerebrosidase activity and alpha-synuclein clearance[J]. J Neurochem， 2016，139（Suppl 1）：198-215.

[11] XILOURI M， BREKK O R， STEFANIS L. Autophagy and alpha-synuclein： relevance to Parkinsons disease and related synucleopathies[J]. Movement Disorders： Official Journal of the Movement Disorder Society， 2016，31（2）：178-192.

[12] HENDERSON M X， SEDOR S， MCGEARY I， et al. Glucocerebrosidase activity modulates neuronal susceptibility to pathological alpha-synuclein insult[J]. Neuron， 2020，105（5）：1-15.

[13] JIANG H， WANG J， ROGERS J， et al. Brain iron metabolism dysfunction in Parkinsons disease[J]. Molecular Neurobiology， 2017，54（4）：3078-3101.

[14] DE FARIAS C C， MAES M， BONIFACIO K L， et al. Parkinsons disease is accompanied by intertwined alterations in iron metabolism and activated immune-inflammatory and oxidative stress pathways[J]. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets， 2017，16（4）：484-491.

[15] LAN A P， CHEN J， CHAI Z F， et al. The neurotoxicity of iron， copper and cobalt in Parkinsons disease through ROS-mediated mechanisms[J]. Bio Metals， 2016，29（4）：665-678.

[16] YANG W S， SRIRAMARATNAM R， WELSCH M E， et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4[J]. Cell， 2014，156（1/2）：317-331.

[17] DENG H， WANG P， JANKOVIC J. The genetics of Parkinson disease[J]. Ageing Res Rev， 2018，42：72-85.

[18] TRANCHANT C. Introduction and classical environmental risk factors for Parkinson[J]. Revue Neurologique， 2019，175（10）：650-651.

[19] CHESNOKOVA A Y， EKIMOVA I V， PASTUKHOV Y F. Parkinsons disease and aging[J]. Adv Gerontol， 2018，31（5）：668-678.

[20] BERGSLAND N， ZIVADINOV R， SCHWESER F， et al. Ventral posterior substantia nigra iron increases over 3 years in Parkinsons disease[J]. Movement Disorders： Official Journal of the Movement Disorder Society， 2019，34（7）：1006-1013.

[21] YU Shuyang， CAO Chenjie， ZUO Lijun， et al. Clinical features and dysfunctions of iron metabolism in Parkinson disease patients with hyper echogenicity in substantia nigra： a cross-sectional study[J]. BMC Neurology， 2018，18（1）：9-17.

[22] WYPIJEWSKA A， GALAZKA-FRIEDMAN J， BAUMIN-GER E R， et al. Iron and reactive oxygen species activity in Parkinsonian substantia nigra[J]. Parkinsonism & Related Disorders， 2010，16（5）：329-333.

[23] BELAIDI A A， BUSH A I. Iron neurochemistry in Alzheimers disease and Parkinsons disease： targets for therapeutics[J]. J Neurochem， 2016，139（Suppl 1）：179-197.

[24] GOZZELINO R， AROSIO P. Iron homeostasis in health and disease[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2016，17（1）：130-144.

[25] SUN Y， PHAM A N， WAITE T D. The effect of vitamin C and iron on dopamine-mediated free radical generation： implications to Parkinsons disease[J]. Dalton Transactions （Cambridge， England：2003）， 2018，47（12）：4059-4069.

[26] GEGG M E， BURKE D， HEALES S J， et al. Glucocerebrosidase deficiency in substantia nigra of parkinson disease brains[J]. Annals of Neurology， 2012，72（3）：455-463.

[27] MURPHY K E， GYSBERS A M， ABBOTT S K， et al. Reduced glucocerebrosidase is associated with increased alpha-synuclein in sporadic Parkinsons disease[J]. Brain， 2014，137（Pt 3）：834-848.

[28] MISHRA A， CHANDRAVANSHI L P， TRIGUN S K， et al. Ambroxol modulates 6-hydroxydopamine-induced temporal reduction in glucocerebrosidase （GCase） enzymatic activity and Parkinsons disease symptoms[J]. Biochem Pharmacol， 2018，155：479-493.

[29] LUZIO J P， PRYOR P R， BRIGHT N A. Lysosomes： fusion and function[J]. Nature Reviews. Molecular Cell Biology， 2007，8（8）：622-632.

[30] KAO J K， WANG S C， HO L W， et al. Chronic iron overload results in impaired bacterial killing of THP-1 derived macrophage through the inhibition of lysosomal acidification[J]. PLoS One， 2016，11（5）：e0156713.

[31] MAZZULLI J R， XU Y H， SUN Y， et al. Gaucher disease glucocerebrosidase and alpha-synuclein form a bidirectional pathogenic loop in synucleinopathies[J]. Cell， 2011，146（1）：37-52.

[32] WANG R， WANG Y， QU L， et al. Iron-induced oxidative stress contributes to alpha-synuclein phosphorylation and up-regulation via polo-like kinase 2 and casein kinase 2[J]. Neurochem Int， 2019，125：127-135.

[33] GANGULY U， BANERJEE A， CHAKRABARTI S S， et al. Interaction of alpha-synuclein and Parkin in iron toxicity on SH-SY5Y cells： implications in the pathogenesis of Parkinsons disease[J]. Biochemical Journal， 2020. doi：org/10.1042/BCJ20190676.

[34] ROCHA E M， SMITH G A， PARK E， et al. Sustained systemic glucocerebrosidase inhibition induces brain alpha-synuclein aggregation， microglia and complement C1q activation in mice[J]. Antioxidants & Redox Signaling， 2015，23（6）：550-564.

[35] XU YH， SUN Y， RAN H， et al. Accumulation and distribution of alpha-synuclein and ubiquitin in the CNS of Gaucher disease mouse models[J]. Mol Genet Metab， 2011，102（4）：436-447.

[36] MANNING-BOG A B， SCHULE B， LANGSTON J W. Alpha-synuclein-glucocerebrosidase interactions in pharmacological Gaucher models： a biological link between Gaucher disease and Parkinsonism[J]. Neurotoxicology， 2009，30（6）：1127-1132.

（本文編輯 馬偉平）