戴瑩瑩 閻春玲 畢明霞 焦倩 杜希恂 姜宏

[摘要] 目的 探討載脂蛋白D （Apo D）對(duì)多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用。方法 首先觀察25～500 μmol/L的1-甲基-4-苯基吡啶陽(yáng)離子（MPP+）對(duì)MES23.5細(xì)胞存活率的影響，確定最佳造模濃度;在此基礎(chǔ)上觀察2～32 nmol/L Apo D預(yù)處理對(duì)200 μmol/L的MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果 與MPP+處理組相比，8 nmol/L Apo D預(yù)處理可明顯拮抗MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞存活率的降低，差異有顯著性（F=85.06，P<0.01）。結(jié)論 外源性Apo D可拮抗多巴胺能神經(jīng)元損傷并發(fā)揮其保護(hù)作用，這為PD的防治提供新的思路。

[關(guān)鍵詞] 帕金森病;載脂蛋白D類;多巴胺能神經(jīng)元

[中圖分類號(hào)] R742.5 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號(hào)] 2096-5532（2020）02-0140-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.093 [開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200519.1433.005.html;2020-05-20 08：59

[ABSTRACT] Objective To investigate the protective effect of apolipoprotein D （Apo D） on dopaminergic neurons. Methods First， the effect of 25-500 μmol/L 1-methyl-4-phenylpyridiniumion （MPP+） on the survival rate of MES23.5 cells was observed to find the optimal modeling concentration. Then on this basis， the effect of 2-32 nmol/L Apo D pre-treatment on the survival rate of MES23.5 cells induced by 200 μmol/L MPP+ was observed. ?Results Compared with the MPP+ treatment group， 8 nmol/L Apo D pre-treatment could significantly antagonize MPP+-induced decrease in the survival rate of MES23.5 cells （F=85.06，P<0.01）. ?Conclusion Exogenous Apo D can antagonize dopaminergic neuronal injury and exert a protective effect， which provides new ideas for the prevention and treatment of Parkinsons disease.

[KEY WORDS] Parkinson disease; apolipoproteins D; dopaminergic neurons

帕金森?。≒D）是一種多發(fā)于中老年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，主要臨床癥狀為靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)反射性障礙等[1-2]。PD的主要病理特征是中腦黑質(zhì)（SN）多巴胺能神經(jīng)元選擇性缺失，殘存的神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)以α-突觸核蛋白（α-Syn）異常聚集為主形成的路易小體（LBs）[3-4]。PD的病因尚未明確，與氧化應(yīng)激、自由基形成、金屬動(dòng)態(tài)平衡和線粒體功能障礙相關(guān)的機(jī)制都有涉及[5]。最近的研究表明，PD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦膽固醇水平升高，而載脂蛋白參與膽固醇穩(wěn)態(tài)的維持，載脂蛋白與PD之間可能存在聯(lián)系[6-8]。載脂蛋白D（Apo D）是載脂蛋白家族的成員之一[9]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Apo D主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，為在衰老的大腦、神經(jīng)退行性疾病和精神疾病中始終過(guò)量表達(dá)的少數(shù)基因之一[10-11]。研究表明，轉(zhuǎn)基因小鼠Apo D過(guò)表達(dá)導(dǎo)致其對(duì)氧化應(yīng)激的抗性增強(qiáng)[12-15]。相反，小鼠、植物和果蠅中的Apo D失活導(dǎo)致氧化抗性降低，從而降低其存活率[13，16-19]。那么，Apo D對(duì)PD病理細(xì)胞模型是否具有保護(hù)作用呢？本研究探討Apo D對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的作用，以期為PD的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將MES23.5細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)0.05的胎牛血清和100 kU/L青霉素和鏈霉素的DMEM-F12（Gibco，USA）培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細(xì)胞以1×105/cm2的密度接種在平板中，生長(zhǎng)到70%～80%融合度，將細(xì)胞分為4組。①對(duì)照組：與ddH2O預(yù)孵育48 h;②MPP+處理組：與ddH2O預(yù)孵育24 h，然后加入200 μmol/L MPP+孵育24 h;③Apo D處理組：與2～32 nmol/L Apo D（Biovendor，USA）共孵育48 h;④Apo D-MPP+組：與2～32 nmol/L ApoD預(yù)孵育24 h，然后與200 μmol/L MPP+孵育24 h。

1.2 細(xì)胞活力測(cè)定

應(yīng)用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞活力。各組細(xì)胞經(jīng)處理后，將培養(yǎng)基換成最終濃度為5 g/L的MTT溶液，37 ℃條件下放置4 h。棄去培養(yǎng)基，向各孔加入100 μL DMSO，于搖床震蕩10 min至晶體完全溶解，使用酶標(biāo)儀（Molecular Device，USA）分別檢測(cè)494 nm和630 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度均值（A494-A630）/陰性對(duì)照組吸光度均值（A494-A630）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料結(jié)果以±s表示。多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），繼以 Tukey方法進(jìn)行兩兩均數(shù)間的比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 不同濃度MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞存活率比較

MES23.5細(xì)胞經(jīng)25～500 μmol/L的MPP+預(yù)處理24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，25～500 μmol/L MPP+處理組細(xì)胞存活率降低（F=52.90，P<0.001），其中200 μmol/L處理組細(xì)胞的存活率降低了34.6%（P<0.001）?？紤]到200 μmol/L MPP+是引起細(xì)胞損傷的最低濃度，因此選擇將其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Apo D處理對(duì)MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞存活率降低的影響

使用2～32 nmol/L濃度范圍的Apo D預(yù)處理24 h，可以拮抗MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性（F=13.20，P<0.001），并在8 nmol/L發(fā)揮其最大的保護(hù)作用（P<0.01）。見(jiàn)表2。不同濃度的Apo D處理沒(méi)有產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用（F=4.06，P<0.001）。見(jiàn)表3。因此，Apo D預(yù)處理對(duì)MPP+處理的MES23.5細(xì)胞具有保護(hù)作用。

3 討 ?論

有研究顯示，Apo D在神經(jīng)退行性疾病中上調(diào)，延長(zhǎng)了壽命并增加了果蠅的抗逆性[14]。PD病人的SN中Apo D也增加[20]，這意味著PD病人腦中Apo D與PD有關(guān)。Apo D可自由通過(guò)血-腦脊液屏障。有研究顯示，2、4、8 nmol/L Apo D可拮抗PQ處理的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的降低[12]。那么，外源給予Apo D對(duì)多巴胺能神經(jīng)元是否發(fā)揮保護(hù)作用呢？本研究結(jié)果顯示，Apo D預(yù)孵育可以拮抗MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞存活率的降低，說(shuō)明Apo D對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用;其保護(hù)作用與濃度有關(guān)，以8 nmol/L濃度保護(hù)作用最大。而單獨(dú)給予不同濃度Apo D處理MES23.5細(xì)胞的存活率沒(méi)有變化，說(shuō)明外源性使用Apo D對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。因此，推測(cè)臨床使用Apo D應(yīng)該是安全的，這為Apo D的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

MPP+可以通過(guò)多巴胺再攝取系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞，并抑制線粒體呼吸鏈的復(fù)合體Ⅰ產(chǎn)生氧化應(yīng)激，線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激引起的多巴胺能神經(jīng)元變性是PD的重要特征[21]。研究表明，Apo D在轉(zhuǎn)基因小鼠中的過(guò)度表達(dá)可使其對(duì)氧化應(yīng)激的抗性增強(qiáng)[12]。由此我們推測(cè)， Apo D對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用可能與其抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

總之，Apo D對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有拮抗作用，從而保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激的損傷，Apo D可能對(duì)PD的治療具有臨床意義。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）