王 倩 馬振濱 劉 琪 孫憲昌

1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢中心，山東 濱州 256600；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000

神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(neurodegenerative diseases，NDDs)是一類以特定腦區(qū)神經(jīng)元退化和不可逆性丟失為特征伴有腦功能不可逆損傷的病變，包括帕金森病(Parkinson's disease，PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、亨廷頓病(Huntington's disease, HD)和肌萎縮性側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)。目前，約有3 000萬(wàn)人受NDDs的影響，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。因?yàn)镹DDs的確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚，所以臨床上缺乏有效的治療方法。近年來(lái)的研究顯示以小膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征的神經(jīng)炎癥反應(yīng)在NDDs的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著決定性作用[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫監(jiān)視細(xì)胞，受到炎性刺激后可以迅速激活，是腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志。小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活可釋放大量的具有損傷作用的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元進(jìn)行性、不可逆的損傷，這與PD、AD等NDDs密切相關(guān)[2-3]。因此抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少致炎介質(zhì)的釋放成為了篩選治療或延緩NDDs藥物的重要靶點(diǎn)。

我國(guó)具有豐富的中藥資源，其中許多中藥或中藥單體都具有一定的抗炎作用。從中篩選出有效而且副作用小的抗炎藥物已成為目前研究的熱點(diǎn)。人參皂苷Rb1是我國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)虛要藥人參的主要有效成分，具有豐富的生理學(xué)活性和藥理學(xué)作用。既往研究顯示Rb1具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基及對(duì)抗細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用[4]。而近年來(lái)的研究則表明Rb1具有較好的抗炎活性，對(duì)神經(jīng)炎癥導(dǎo)致的各種神經(jīng)退行性疾病可能具有一定的治療作用[5]；但是相關(guān)方面的研究較少。本研究選用BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系，利用脂多糖將其激活；觀察Rb1對(duì)炎癥因子釋放的影響并探討其可能的機(jī)制，為進(jìn)一步了解Rb1的抗炎作用及機(jī)制、尋找NDDs的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

人參皂苷Rb1購(gòu)自上海同田生物技術(shù)有限公司，純度為99%；BV2小膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；噻唑藍(lán)MTT購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Roche公司；SYBRGreen試劑盒購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司；PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)并合成；BCA試劑盒及RIPA裂解液購(gòu)自碧云天公司；兔抗COX-2抗體及iNOS抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔抗-磷酸化IkB抗體、兔抗-IκB抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司。

1.2 主要儀器

倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；多功能酶標(biāo)分析儀，深圳雷社生命科學(xué)股份有限公司；CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Electron Corporation公司；PCR儀，BioRad公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Eppendorf公司；UVP Biospectrum，美國(guó)UVP公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞置于含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、100 KU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞，以5×107/L的密度接種于96孔板，每孔100 μL。將細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組(用1 μg/mL的LPS處理細(xì)胞24 h)、Rb1組(50 μM的Rb1處理細(xì)胞24 h)、Rb1+LPS組(應(yīng)用1 μg/mL的LPS和不同濃度的Rb1同時(shí)處理細(xì)胞24 h，Rb1的濃度分別是10、20、50 μM)。處理完成后，每孔加入0.5% MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h；吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，低速振蕩10 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值。

1.4.2實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)(real time RT-PCR)檢測(cè)TNF-α和IL-1β mRNA水平變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板，每孔3 mL，細(xì)胞的分組及處理同前“2.1”項(xiàng)。細(xì)胞處理完畢后，采用Trizol法提取總RNA，然后取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，繼而應(yīng)用設(shè)計(jì)好的目的基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增，采用SYBRGreen染料法檢測(cè)TNF-α、IL-1β及管家基因GAPDH的表達(dá)。以上操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。最終，根據(jù)反應(yīng)CT值，應(yīng)用2-ΔΔCT法計(jì)算待測(cè)樣品中目的基因的相對(duì)數(shù)量。

本實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的目的基因引物為TNF-α, F 5′-TAT GGC CCA GAC CCT CAC A-3′，R 5′-GGA GTA GAC AAG GTA CAA CCC ATC-3′；IL-1β，F(xiàn) 5′-ACC TGG GCT GTC CTG ATG AGA GG-30-3′，R 5′-TGT TGA TGT GCT GCT GCG AGA T30-3′；GAPDH，F(xiàn) 5′-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3′，R 5′-TTGCTG TTG AAG TCG CAG GAG-3′。

1.4.3免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)iNOS、COX-2、IKK、phospho-IKK、IκB及phospho-IκB蛋白水平的變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板，每孔3 mL，細(xì)胞的分組及處理同MTT實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞經(jīng)藥物處理后棄掉培養(yǎng)液，用冰冷的無(wú)菌0.01 M PBS洗滌1次，用含1 mM蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA溶液100 μL裂解細(xì)胞提取蛋白。應(yīng)用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，各組取等量蛋白(20 μg)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(10%)電泳，然后將凝膠中分離的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素薄膜上(PVDF膜)，PVDF膜用5% 脫脂牛奶封閉后一抗COX-2 (1∶1 000),iNOS (1∶2 000), IκB (1∶1 000), phospho-IκB (1∶1 000), IKK and phospho-IKK (1∶1 000) ,β-actin (1∶5 000) 4℃孵育過(guò)夜。再將膜轉(zhuǎn)移至二抗工作液(1∶10 000)中室溫?fù)u床孵育1 h，然后用ECL化學(xué)發(fā)光底物液(臨用前將酶底物與加強(qiáng)發(fā)光劑按1∶1體積比混勻)進(jìn)行顯色，應(yīng)用美國(guó)UVP Biospectrum 810全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)對(duì)Western blot結(jié)果顯影并進(jìn)行積分光密度(integrated optical density, IOD)測(cè)定。測(cè)量結(jié)果以目的蛋白與β-actin的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 LPS及Rb1對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

細(xì)胞分別經(jīng)LPS(1 μg/mL)、Rb1(50 μM)、LPS+Rb1(10、20、50 μM)處理24 h，應(yīng)用MTT法檢測(cè)其對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞存活的影響。結(jié)果顯示，各組細(xì)胞之間均無(wú)明顯差異(圖1)，說(shuō)明LPS及Rb1對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的存活均沒(méi)有影響，既不促進(jìn)其增殖，也不會(huì)引起細(xì)胞毒性。

圖1 人參皂苷Rb1對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響(n=3)

2.2 Rb1對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)的影響

為了評(píng)估Rb1對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抑制作用，我們應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)了LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá)變化及Rb1處理對(duì)其產(chǎn)生的影響。結(jié)果如圖2所示，應(yīng)用LPS處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，炎癥因子TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組均明顯升高；而應(yīng)用不同濃度的Rb1共處理后，TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá)量均有不同程度的下降，其中20 μM與50 μM人參皂苷Rb1對(duì)LPS的抑制作用較為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而20 μM與50 μM組相比較并無(wú)明顯差異(表1)。

2.3 Rb1對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)iNOS及COX-2蛋白表達(dá)的影響

為了評(píng)估Rb1對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抑制作用，應(yīng)用Western blot檢測(cè)了小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)促炎酶iNOS及COX-2蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果如圖3所示，LPS處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后可使iNOS及COX-2的表達(dá)量明顯增加，應(yīng)用Rb1處理后，iNOS及COX-2的表達(dá)量均有不同降低，其中20 μM和50 μM組與LPS組相比較明顯降低，而20 μM與50 μM組相比并無(wú)明顯差異(表2)。以上結(jié)果說(shuō)明Rb1可通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)促炎酶的表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)。

2.4 Rb1對(duì)LPS誘導(dǎo)的促炎信號(hào)通路NF-κB的抑制作用

為了進(jìn)一步了解Rb1抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，我們應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)了炎癥信號(hào)通路NF-κB中IκB、IKK及其磷酸化水平的變化。結(jié)果如圖4顯示，與對(duì)照組相比，應(yīng)用LPS處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，IκB、IKK的磷酸化水平明顯升高；而同時(shí)應(yīng)用Rb1處理后，磷酸化IκB、IKK的水平明顯降低(表3)。提示Rb1抑制炎癥反應(yīng)的機(jī)制可能與其抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

***P<0.001，vs.對(duì)照組；^P<0.05，^^P<0.001，vs.LPS組。

表1 人參皂苷Rb1對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)的影響(n=3)

注：與對(duì)照組比較，***P<0.001；與LPS組比較，^^P<0.01。

**P<0.01，***P<0.001，vs.對(duì)照組；^P<0.05，vs.LPS組。

表2 人參皂苷Rb1對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS及COX-2蛋白表達(dá)的影響(n=3)

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001；與LPS組比較，^P<0.01。

**P<0.01，***P<0.001，vs.對(duì)照組；^P<0.05，^^P<0.01，vs.LPS組。

表3 人參皂苷Rb1對(duì)BV2細(xì)胞內(nèi)I(B及IKK蛋白磷酸化水平的影響(n=3)

注：與對(duì)照組比較，***P<0.001；與LPS組比較，^P<0.01，^^P<0.001。

3 討 論

越來(lái)越多的證據(jù)表明以小膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征的神經(jīng)炎癥在NDDs的發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫監(jiān)視細(xì)胞，約占腦內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的12%，生理情況下呈分枝狀的靜止?fàn)顟B(tài)，對(duì)周圍環(huán)境變化十分敏感，當(dāng)受到炎性刺激后可以迅速激活并伴隨著細(xì)胞形態(tài)、抗原表型及功能的改變，是腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志[3,6-7]。小膠質(zhì)細(xì)胞的適度激活對(duì)于組織損傷后的修復(fù)及維持腦內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有重要作用；但是炎癥刺激持續(xù)存在會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)期過(guò)渡激活并釋放大量的促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、ROS、NO)，造成神經(jīng)元的損傷[8-10]。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活成為治療或延緩NDDs的新策略。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上觀察了人參皂苷Rbl對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用，并初步探討了其可能的機(jī)制。

LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，與可溶性LPS結(jié)合蛋白(LPS binding protein, LBP)及CD14形成復(fù)合物后，作用于小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路蛋白激酶的激活，多種促炎因子、自由基合成酶基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，是一種強(qiáng)有力的炎癥誘導(dǎo)劑[11-12]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用LPS處理后的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子(IL-1β、TNF-α)及炎癥介質(zhì)(iNOS、COX-2)的表達(dá)量明顯升高，說(shuō)明應(yīng)用1 μg/mL的LPS能明顯激活BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，能夠模擬炎癥反應(yīng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的變化過(guò)程及作用。在此基礎(chǔ)上，我們應(yīng)用人參皂苷Rb1進(jìn)行干預(yù)，觀察Rb1抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的效果，結(jié)果顯示Rb1能夠劑量依賴性的抑制促炎介質(zhì)IL-1β、TNF-α、iNOS及COX-2的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了Rb1具有一定的抗炎作用，能抑制炎癥反應(yīng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)渡活化及其帶來(lái)的損傷，其神經(jīng)保護(hù)作用可能與此作用有關(guān)。

人參皂苷(ginsenosides)是人參的主要活性成份，它是由30個(gè)碳原子組成的三萜達(dá)瑪烷環(huán)類衍生物。目前已經(jīng)從不同人參中分離提取出80余種單體，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分為人參二醇(Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3, Rh2, Rs1 )、人參三醇(Re,Rf, Rg1, Rg2, Rh1)和齊墩果酸型3種皂苷。其中Rb1是人參皂苷中含量最為豐富的單體成分，近年來(lái)研究已證實(shí)人參皂苷Rb1是人參作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要成分之一，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用[4,13-14]。雖然關(guān)于人參皂苷Rb1作用的研究很多，但其相應(yīng)的機(jī)制并未完全清楚，多數(shù)研究主要關(guān)注其抗氧化、抗凋亡、保護(hù)血腦屏障方面的作用，關(guān)于其抗炎作用及其機(jī)制的研究相對(duì)較少[5,15-16]。本研究為了進(jìn)一步揭示人參皂苷Rb1的抗炎作用機(jī)制，在實(shí)驗(yàn)中觀察了炎癥相關(guān)的NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)變化。NF-κB是一種與炎癥密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，靜息狀態(tài)下，存在于胞漿中，與抑制性蛋白(IκB)結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞被激活時(shí)，特異性激酶可將IκB磷酸化，使其快速被蛋白小體降解，NF-κB與IκB解離并釋出，進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)特定結(jié)合序列結(jié)合，增加相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄速度，促進(jìn)了多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)[17]。NF-κB激活主要受到 IκB和蛋白激酶(IKK)的調(diào)節(jié)，活化的IKK能夠誘導(dǎo) IκB磷酸化，繼而激活NF-κB，因此抑制IκB和IKK活性，進(jìn)而阻斷 NF-κB通路，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，已成為篩選抗神經(jīng)炎癥的天然產(chǎn)物的重要靶點(diǎn)[18-19]。已有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷可通過(guò)抑制NF-κB通路減輕RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的釋放[20]。本研究觀察了人參皂苷Rb1對(duì)該通路的影響，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用人參皂苷Rb1可明顯抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi) IκB和IKK的磷酸化水平，進(jìn)一步證實(shí)Rb1的抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用可能與其抑制NF-κB信號(hào)通路激活密切相關(guān)。

我國(guó)藥用植物豐富、種類繁多、藥用歷史悠久，對(duì)天然產(chǎn)物特別是中藥的活性成分進(jìn)行抗神經(jīng)炎癥的篩選，已成為治療神經(jīng)退行性疾病的新亮點(diǎn)。本研究應(yīng)用BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察了人參皂苷Rb1的抗炎作用，證實(shí)了Rb1可通過(guò)抑制炎癥信號(hào)通路NF-κB減少炎癥介質(zhì)的釋放，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可發(fā)揮抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用；這為尋找神經(jīng)退行性疾病新的治療靶點(diǎn)提供了重要參考。當(dāng)然，Rb1的抗炎作用機(jī)制及在動(dòng)物體內(nèi)的抗炎效果還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。