孫 聰， 郭 帥， 寧 娜， 侯曉鴻， 王昌圖， 原 媛， 王曉暉，， 王 麗△

（山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1病理學(xué)教研室，2形態(tài)學(xué)實驗室，山西太原030001）

心功能不全是多種心臟疾病的終末階段，是重要的全球公共健康問題，但發(fā)病機制尚未完全闡明［1］。有證據(jù)表明，心肌細(xì)胞死亡是心功能不全發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［2］。β1-腎上腺素受體自身抗體（β1-adrenergic receptor antibody，β1-AA）可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡［3］。自身抗體是指針對人體自身抗原產(chǎn)生的抗體［4］，而β1-AA是針對β1-腎上腺素受體細(xì)胞外第2環(huán)（the second extracellular loop ofβ1-adrenergic receptor，β1-AR-ECII）產(chǎn)生的抗體［3］。約 40%～60%心功能不全患者血清中均可檢測到β1-AA［5］，其與心肌細(xì)胞膜表面β1-AR-ECII結(jié)合發(fā)揮類激動劑樣作用，引起心肌細(xì)胞持續(xù)性損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡［3］，提示β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡在心功能不全的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制，自噬流降低可引起細(xì)胞內(nèi)有害蛋白的累積，進而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［6］。我們課題組前期結(jié)果表明，心肌自噬流降低是β1-AA誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡的重要原因，采用自噬激動劑上調(diào)心肌細(xì)胞自噬流可抑制β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡［7］。因此，逆轉(zhuǎn)β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬流下降成為有效抑制心肌細(xì)胞死亡的切入點。

脂聯(lián)素（adiponectin，APN）可與細(xì)胞膜表面脂聯(lián)素受體（adiponectin receptor，AdipoR）結(jié)合，使下游AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）磷酸化，進而上調(diào)心肌細(xì)胞自噬流［8-9］。APN作為脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可增加心肌細(xì)胞存活率［10］。然而APN對于β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡及自噬流下降是否具有抑制作用，目前尚無文獻報道。因此，本實驗擬通過體外研究，觀察APN是否可以抑制β1-AA誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞自噬流下降，并利用抑制劑干預(yù)AMPK磷酸化水平，從分子水平探討APN調(diào)控自噬的可能機制，為β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬流下降的調(diào)控提供實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動物和細(xì)胞

實驗動物：清潔級8周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重180～200 g，山西醫(yī)科大學(xué)動物中心［許可證號：SCXK（晉）2015-0001］提供。實驗細(xì)胞：H9c2大鼠心肌細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。

2 主要試劑

β1-AR-ECII抗原肽段（吉爾生化上海有限公司）；完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑（Sigma-Aldrich）；重組鼠 APN球狀結(jié)構(gòu)域 gAcrp30（PeproTech）；LC3B和P62抗體（Abcam）；AMPK和p-AMPK抗體（Cell Signaling Technology）；Compound C（Selleck）；GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠IgG（中杉金橋生物公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8；日本同仁化學(xué)研究所）；SYBR Green試劑盒（TaKaRa）。

3 主要方法

3.1 實驗分組 將H9c2細(xì)胞分為對照（control）組（1μmol/L陰性IgG處理細(xì)胞24 h）、β1-AA組（1μmol/Lβ1-AA處理細(xì)胞 24 h）、APN+β1-AA組（10μg/L APN預(yù)處理細(xì)胞1 h后加入1μmol/Lβ1-AA處理24 h）、APN組（10μg/L APN處理細(xì)胞25 h）、Compound C+APN+β1-AA組（20μmol/L Compound C預(yù)處理細(xì)胞30 min后加入10μg/L APN預(yù)處理1 h，最后加入1μmol/Lβ1-AA處理細(xì)胞24 h）和β1-AA+Compound C組（20μmol/L Compound C預(yù)處理細(xì)胞30 min后加入1μmol/Lβ1-AA作用24 h）。

3.2 主動免疫大鼠 選取12只8周齡雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為免疫（β1-AR-ECII）組和control組，每組6只。將β1-AR-ECII抗原肽段用Na2CO3溶液溶解稀釋，并和完全弗氏佐劑1∶1乳化混勻后，多點背部皮下注射（0.4μg/g），即首次免疫。隨后采用已稀釋的β1-AR-ECII抗原肽段與不完全弗氏佐劑1∶1乳化，單點背部皮下注射，每隔2周加強免疫1次，共免疫8周；control組用等量Na2CO3溶液替代抗原溶液，實驗方案同免疫組。

3.3 親和層析法提純大鼠血清中β1-AA 采用親和層析法提純主動免疫大鼠血清中的β1-AA，應(yīng)用于離體實驗研究。從4°C取出層析柱在室溫下放置30 min，將三蒸水注入層析柱內(nèi)部，沖去保存在柱子中的乙醇，用結(jié)合緩沖液沖洗柱子后，抽取含有β1-AA的血清濾過柱子并用洗脫緩沖液沖洗柱子，使β1-AA隨同洗脫緩沖液滴到EP管中，隨后用BCA試劑盒進行濃度檢測。

3.4 CCK-8實驗 本實驗采用CCK-8法檢測H9c2細(xì)胞活力。將細(xì)胞進行消化后，大約2×109/L的密度將細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板，每孔100μL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后換液，加入5、10和30μg/L APN預(yù)處理1 h，隨后加入1μmol/Lβ1-AA作用24 h后，每孔加入10μL CCK-8試劑混勻，放入孵箱中2 h，觀察到溶液顏色變?yōu)樽攸S色時，用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處各組吸光度（A）值。根據(jù)各組的A值計算各實驗組相較于對照組的細(xì)胞活力。細(xì)胞相對活力（%）=（實驗組A值-空白對照組A值）/（陰性對照組A值-空白對照組A值）×100%。

3.5 real-time PCR 本實驗采用real-time PCR方法檢測beclin-1和LC3B的mRNA水平。將細(xì)胞進行消化，接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，進行相應(yīng)預(yù)處理，首先采用500μL的PBS進行沖洗，將PBS倒掉并用移液槍將殘余的PBS吸凈，然后向每孔細(xì)胞中加入500μL的TRIzol試劑進行裂解，提取總RNA，0.5μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，選用SYBR Green試劑盒擴增cDNA產(chǎn)物，確認(rèn)擴增曲線和溶解曲線。引物序列如下：beclin-1（GenBank ID：NM_001034117.1）的上游引物序列為5′-GAAACTGGACACGAGCTTCAAGA-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-ACCATCCTGGCGAGTTTCAATA-3′；LC3B（GenBank ID： NM_022867.2）的 上 游 引 物 序 列 為 5′-AGCTCTGAAGGCAACAGCAACA-3′，下游引物序列為 5′-GCTCCATGCAGGTAGCAGGAA-3′；GAPDH（Gen-Bank ID：NM_017008.3）的上游引物序列為 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物序列為 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。 選 用GAPDH作為內(nèi)參照。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行計算。

3.6 Western blot 本實驗采用Western blot方法檢測LC3B、P62、AMPK和p-AMPK的蛋白表達水平。將細(xì)胞進行消化，接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁，進行相應(yīng)預(yù)處理后，向每孔細(xì)胞中加入50μL RIPA裂解液、0.5μL PMSF和0.5μL磷酸酶抑制劑。冰上裂解1 h，收取細(xì)胞樣品，離心后取上清，進行BCA法蛋白濃度檢測。選擇上樣量為40μg，體系為10μL，進行SDS-PAGE分離后，用PVDF膜轉(zhuǎn)膜。再與相應(yīng)的Ⅰ抗進行反應(yīng)，4°C過夜，用TBST進行洗膜，與相應(yīng)的Ⅱ抗在室溫下進行反應(yīng)，用TBST洗膜后，將膜置于全自動曝光儀內(nèi)，ECL化學(xué)發(fā)光后，曝光拍攝條帶，ImageJ軟件分析灰度值，將GAPDH作為內(nèi)參照，計算不同蛋白的相對表達量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 APN抑制β1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力下降

CCK-8結(jié)果顯示，與control組相比，β1-AA誘導(dǎo)心肌細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05），10μg/L APN可顯著逆轉(zhuǎn)β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力下降（P＜0.05），5 μg/L和30μg/L APN均不能恢復(fù)β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力下降（P＞0.05），見圖1。因此本研究選擇10μg/L為APN的濃度進行后續(xù)實驗研究。

Figure 1.Adiponectin（APN）inhibited the decrease in viability of the H9c2 cells induced byβ1-AA.The H9c2 cells was pretreated with APN（5，10 and 30μg/L）for 1 h before addingβ1-AA（1μmol/L），and CCK-8 assay was performed to measure cell viability.Mean±SEM.n=12.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vsβ1-AA group.圖1 APN抑制β1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力下降

2 β1-AA誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞自噬流下降

real-time PCR結(jié)果顯示，與control組相比，β1-AA誘導(dǎo)beclin-1和LC3B的mRNA水平顯著降低（P＜0.05），見圖2A；Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，β1-AA誘導(dǎo)LC3-II蛋白水平顯著降低（P＜0.05），P62蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖2B。

3 APN抑制β1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬流下降

real-time PCR結(jié)果顯示，與β1-AA組相比，APN顯著上調(diào)beclin-1和LC3B的mRNA水平（P＜0.05），見圖3A；Western blot結(jié)果顯示，與β1-AA組相比，APN預(yù)處理可以顯著逆轉(zhuǎn)β1-AA誘導(dǎo)的LC3-II蛋白水平下降（P＜0.05）及 P62蛋白累積（P＜0.05），見 圖3B。

Figure 2. β1-AA induced the decrease in autophagic flux of the H9c2 cells.A：the mRNA expression of beclin-1 and LC3B in the H9c2 cells was detected after treatment withβ1-AA（1μmol/L）for 24 h；B：the protein levels of LC3-I，LC3-IIand P62 in the H9c2 cells were measured after treatment with β1-AA（1 μmol/L）for 24 h.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control group.圖2 β1-AA誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞自噬流下降

Figure 3. Adiponectin（APN）inhibited the decrease in autophagic flux of the H9c2 cells induced byβ1-AA.A：the mRNA expression of beclin-1 and LC3Bin the H9c2 cells was measured after pretreatment with APN（10μg/L）for 1 h before addingβ1-AA（1μmol/L）；B：the protein levels of LC3-I，LC3-II and P62 in the H9c2 cells were detected after pretreatment with APN（10 μg/L）for 1 h before adding β1-AA（1 μmol/L）.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vsβ1-AA group.圖3 APN抑制β1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬流下降

4 APN抑制β1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞AMPK磷酸化水平下降

Western blot結(jié)果顯示，與 control組相比，β1-AA顯著降低心肌細(xì)胞AMPK的磷酸化水平（P＜0.05），而與β1-AA組相比，APN預(yù)處理可顯著改善β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞AMPK磷酸化水平下降（P＜0.05），見圖4。

5 APN抑制β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬流下降部分依賴AMPK途徑

Figure 4.Adiponectin（APN）inhibited the decrease in phosphorylation of AMPK induced byβ1-AA in the H9c2 cells.The protein levels of p-AMPK and AMPK were determined by Western blot.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vsβ1-AA group.圖4 APN抑制β1-AA誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞AMPK磷酸化水平下降

real-time PCR結(jié)果顯示，與β1-AA組相比，APN預(yù)處理（APN+β1-AA組）可顯著逆轉(zhuǎn)β1-AA誘導(dǎo)的beclin-1和LC3B mRNA水平降低（P＜0.05）；而Compound C預(yù)處理（Compound C+β1-AA組）可進一步降低β1-AA誘導(dǎo)的beclin-1和LC3B mRNA水平（P＜0.05）；當(dāng)應(yīng)用Compound C和APN預(yù)處理（Compound C+APN+β1-AA組），APN則不能逆轉(zhuǎn)β1-AA誘導(dǎo)的beclin-1和LC3B mRNA水平降低（P＜0.05），見圖5A。Western blot結(jié)果顯示，與β1-AA組相比，APN+β1-AA組AMPK磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）；而 Compound C+β1-AA 組和 Compound C+APN+β1-AA組AMPK磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），見圖5B。進一步檢測自噬流，APN+β1-AA組與β1-AA組相比，LC3-II蛋白水平升高，P62蛋白水平下降（P＜0.05）；Compound C+β1-AA組與β1-AA組相比，LC3-II蛋白水平降低（P＜0.05），P62蛋白表達升高（P＜0.05）；而Compound C+APN+β1-AA組LC3-II和P62蛋白水平均顯著下降（P＜0.05），即LC3-II的降低無法被APN逆轉(zhuǎn)，但P62的累積仍可被APN抑制，見圖5B。

討 論

心功能不全是全球公共健康問題，患病率和死亡率居高不下［11］。有證據(jù)表明，心肌細(xì)胞死亡是心功能不全發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［2］。β1-AA可以與心肌細(xì)胞膜表面的β1-AR-ECII結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷累積，影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，進而引起心肌細(xì)胞死亡［12］。我們課題組前期研究也表明，β1-AA可導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞活力降低［13］。然而β1-AA如何導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡尚不清楚。

研究表明，自噬通過降解細(xì)胞內(nèi)受損、變性及衰老的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器實現(xiàn)能量的循環(huán)利用，進而維持細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)［6］。Miceli等［14］報道，單胺氧化酶通過產(chǎn)生過氧化氫引起氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞自噬流下降，導(dǎo)致自噬-溶酶體系統(tǒng)清除受損線粒體的能力下降，進而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)能量代謝紊亂，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡，提示自噬流降低可能參與H9c2心肌細(xì)胞死亡。我們課題組之前的研究結(jié)果表明，β1-AA可誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞自噬流下降，上調(diào)心肌自噬流可抑制β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力下降，抑制心肌自噬流可導(dǎo)致β1-AA誘導(dǎo)的細(xì)胞活力進一步下降［7］，提示自噬流降低參與β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡。因此逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞自噬流下降可能有助于抑制β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡。

APN與自噬流密切相關(guān)［15］。APN是由脂肪細(xì)胞分泌的30 kD的細(xì)胞因子［15］，具有廣泛的心肌細(xì)胞保護作用［10］。APN基因敲除小鼠存在嚴(yán)重的心肌自噬流受損，具體表現(xiàn)為自噬小體的生成及清除減少［16］，提示APN缺乏可誘導(dǎo)心肌自噬流顯著下降。Ahlstrom等［17］報道，在高糖誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌細(xì)胞中存在自噬流下降，而外源性給予APN可上調(diào)骨骼肌細(xì)胞自噬流，表明在離體水平APN可抑制骨骼肌細(xì)胞自噬流下降。為了證實APN對于β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬流下降是否具有抑制作用，我們首先采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力，結(jié)果表明，APN可有效逆轉(zhuǎn)β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力下降。隨后我們進一步采用real-time PCR和Western blot檢測各組自噬相關(guān)蛋白beclin-1、LC3B和P62的表達水平。beclin-1、LC3B和P62為檢測自噬水平的常用指標(biāo)，其中beclin-1代表自噬的起始，在自噬前體和自噬囊泡的形成過程中起著重要作用［18］；LC3B包括LC3-I和LC3-II，LC3-I與腦磷酯結(jié)合酯化形成 LC3-II，LC3-II最終定位于成熟的自噬小體膜上，其與自噬小體數(shù)量呈正相關(guān)［19］；P62蛋白是一種選擇性自噬底物，當(dāng)P62蛋白表達增加，表明自噬底物累積，自噬小體清除減少，自噬流降低［19］。本研究結(jié)果顯示，APN可抑制β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞beclin-1和LC3B mRNA表達下降、LC3-II蛋白水平下降及P62蛋白累積。這提示APN對于β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬流下降具有抑制作用，但具體機制尚不明確。

Figure 5.Adiponectin improved the decreased autophagic flux induced byβ1-AA partially dependent in AMPK signaling.A：the mRNA expressions of beclin-1 and LC3Bwere observed pretreatment with Compound C，adiponectin，or Compound C+adiponectin before addingβ1-AA.B：the protein expressions of P-AMPK，AMPK，LC3 I，LC3 IIand P62 were detected pretreatment with Compound C，adiponectin，or Compound C+adiponectin before adding β1-AA.Means±SEM.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vsβ1-AA group.圖5 APN改善β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬流下降部分依賴AMPK途徑

研究表明，APN可通過AMPK途徑上調(diào)自噬流［20］。AMPK是細(xì)胞能量感知和信號調(diào)控的重要激酶，對自噬流起著正向調(diào)節(jié)作用［21］。APN通過與細(xì)胞膜表面AdipoR結(jié)合，降低細(xì)胞內(nèi)ATP含量，誘導(dǎo)AMPK磷酸化，活化下游Unc-51樣自噬激活激酶1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）激酶復(fù)合物；ULK1是自噬起始的重要激酶復(fù)合物，其通過磷酸化beclin-1，進而啟動自噬；由此可見，APN可通過AMPK-ULK1途徑上調(diào)細(xì)胞自噬流［20-22］。本研究結(jié)果表明，β1-AA可誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞AMPK磷酸化水平下降，而APN可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。為了進一步證明APN是否通過上調(diào)AMPK磷酸化而抑制β1-AA誘導(dǎo)的自噬流下降，我們采用AMPK的抑制劑Compound C抑制AMPK的磷酸化及AMPK介導(dǎo)的自噬激活作用［23］。本研究結(jié)果顯示，Compound C預(yù)處理后，APN無法逆轉(zhuǎn)β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞AMPK磷酸化水平下降，并且自噬流檢測結(jié)果表明APN也無法逆轉(zhuǎn)β1-AA誘導(dǎo)的LC3B和beclin-1 mRNA及LC3-II蛋白水平的降低，提示APN抑制β1-AA誘導(dǎo)的自噬小體生成降低依賴AMPK途徑。同時我們觀察到無論是否抑制AMPK的磷酸化作用，APN均可抑制P62蛋白的累積，即可增加自噬小體的清除，提示APN抑制β1-AA誘導(dǎo)的自噬小體清除降低不依賴AMPK途徑。上述具體機制尚需進一步探討。

綜上所述，本研究采用β1-AR-ECII主動免疫大鼠血清中提純的β1-AA作用于H9c2心肌細(xì)胞，并外源性給予APN，證實APN可抑制β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡及自噬流降低；同時觀察到APN可逆轉(zhuǎn)β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞AMPK磷酸化水平降低；采用Compound C抑制AMPK磷酸化作用后，APN不能抑制β1-AA誘導(dǎo)的自噬小體生成降低，但仍可抑制β1-AA誘導(dǎo)的自噬小體清除降低，提示APN抑制β1-AA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬流下降部分依賴AMPK途徑。