李昕倡， 吳玉蓮， 吳 彤， 李 明， 葉 東， 羅雨淵， 李 巖△

（1廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州510006）

隨著我國(guó)大氣污染形勢(shì)的日益嚴(yán)峻，大氣污染對(duì)人類健康的危害性逐漸被研究者所認(rèn)識(shí)。除嚴(yán)重影響呼吸系統(tǒng)外，大氣污染與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生也密切相關(guān)。多個(gè)流行病學(xué)研究顯示，大氣污染物濃度的升高可導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)病率增高，住院和死亡人數(shù)明顯增加［1-2］，表明大氣污染與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)［2-3］。細(xì)顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）是大氣污染物中致病的主要成分，PM2.5與冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的相關(guān)性已經(jīng)得到流行病學(xué)的證實(shí)，并被確認(rèn)是新的AS致病危險(xiǎn)因子。對(duì)于PM2.5致AS的作用機(jī)制，以往認(rèn)為其主要是通過(guò)全身性炎癥反應(yīng)促進(jìn)AS的發(fā)生，然而隨著研究證實(shí)PM2.5能跨過(guò)肺氣-血屏障進(jìn)入血液循環(huán)［4］，其直接接觸并損傷血管已成為PM2.5致病機(jī)制的研究重點(diǎn)。目前對(duì)于PM2.5致AS的研究主要集中在其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響上，如損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和引起炎癥反應(yīng)等［5-6］，但PM2.5對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞（human vascular smooth muscle cells，HVSMCs）的影響尚不完全清楚。致病因子活化HVSMCs，影響細(xì)胞的增殖和遷移能力是AS發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)［7］，因此本實(shí)驗(yàn)用PM2.5直接染毒HVSMCs，觀察PM2.5對(duì)HVSMCs增殖和遷移的影響，并從p38 MAPK途徑探索其作用機(jī)制，揭示PM2.5的血管毒性作用和機(jī)制。

材料和方法

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器 MCO-175 CO2培養(yǎng)箱（SANYO）；H1850R高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀）；680型酶標(biāo)儀、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和凝膠成像儀（Bio-Rad）；MS800顯微鏡（Olympus）。

1.2 主要試劑 PM2.5（編號(hào)SRM 1649b，Sigma-Aldrich）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；抗MAPK抗體、抗phospho-MAPK-T180/Y182抗體、抗GAPDH抗體和HRP標(biāo)記的II抗（ABclonal）；RIPA細(xì)胞裂解液及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物公司）；SB203580（批號(hào)129-56-6，Target Mol）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞株 HVSMCs購(gòu)自深圳華拓市生物科技有限公司，用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8法觀察PM2.5對(duì)HVSMCs活力的影響 取100μL（5×103個(gè)細(xì)胞）細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，分為對(duì)照組（加入PBS）和不同濃度PM2.5染毒組（終濃度分別為6.25，12.5和25 mg/L），培養(yǎng)24 h后根據(jù)分組進(jìn)行染毒，每組6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書每孔加入CCK-8溶液100μL，孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（染毒組A值-空白組A值）/（對(duì)照組A值-空白組A值）×100%。

2.3 EdU法觀察PM2.5對(duì)HVSMCs增殖的影響取HVSMCs懸液1 mL（1×105個(gè)細(xì)胞）接種于24孔板內(nèi)預(yù)置的載玻片，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，分組同步驟2.2，按照分組進(jìn)行染毒。染毒24 h后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書更換為含50μmol/L EdU的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育3 h，然后按步驟依次進(jìn)行固定和染色，并用Hoechst 33342標(biāo)記細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行采樣觀察。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察PM2.5對(duì)HVSMCs遷移的影響 取HVSMCs細(xì)胞懸液1 mL（5×105個(gè)細(xì)胞）接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后用100μL槍頭垂直在培養(yǎng)板中劃線，PBS清洗脫落的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組和處理同上，按分組分別加入PBS和PM2.5進(jìn)行染毒，分別于0 h和24 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照，測(cè)量劃痕面積并計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

2.5 Transwell法觀察PM2.5對(duì)HVSMCs遷移的影響 取200μL無(wú)血清細(xì)胞懸液（1×104個(gè)細(xì)胞）加入Transwell小室上室，實(shí)驗(yàn)分組和處理同上，按照分組加入PBS和PM2.5染毒；下室加入含15%FBS的DMEM培養(yǎng)基500μL，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出上室用PBS清洗3次，多聚甲醛固定20 min，風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，用實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)比值代表細(xì)胞遷移能力的變化。

2.6 Western blot法檢測(cè)p38 MAPK的磷酸化水平取HVSMCs懸液1 mL（5×105個(gè)細(xì)胞）接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后用終濃度為12.5 mg/L的PM2.5對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒，另設(shè)對(duì)照組。分別在染毒后不同時(shí)點(diǎn)（20、40、60和120 min）用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取15μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，常規(guī)轉(zhuǎn)膜、BSA封閉、加入I抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜后用TBST洗滌3次，再加入II抗（1∶5 000）孵育2 h，最后加入ECL發(fā)光液曝光、拍照，使用ImageJ軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算磷酸化蛋白與總蛋白的比值。

2.7 p38 MAPK在PM2.5致HVSMCs增殖和遷移中的作用 實(shí)驗(yàn)分為PM2.5組和SB203580+PM2.5組，其中PM2.5組僅給予12.5 mg/L的PM2.5進(jìn)行染毒，SB203580+PM2.5組則先給予10μmol/L的SB203580干預(yù)2 h后，再給予相應(yīng)濃度的PM2.5進(jìn)行染毒，在PM2.5染毒后用上述方法進(jìn)行細(xì)胞增殖和遷移能力的檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多樣本組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組樣本間檢測(cè)則采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PM 2.5對(duì)HVSMCs增殖的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，在6.25～25 mg/L濃度范圍內(nèi)PM2.5染毒使HVSMCs的活力明顯增加，與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01），其中在濃度為12.5 mg/L時(shí)作用效果最強(qiáng)，見圖1。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用EdU標(biāo)記法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，也得到了類似的結(jié)果，可見視野內(nèi)綠染細(xì)胞數(shù)明顯增多，見圖2。上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PM2.5可促進(jìn)HVSMCs的增殖。

Figure 1.The viability of HVSMCs exposed to PM2.5 for 24 h was measured by CCK-8 assay.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group.圖1 CCK-8法檢測(cè)不同濃度PM2.5對(duì)HVSMCs活力的影響

Figure 2.The proliferation of HVSMCs exposed to PM2.5 for 24 h was detected by EdU staining.The scale bar=100μm.圖2 Ed U染色法檢測(cè)不同濃度PM2.5對(duì)HVSMCs增殖的影響

2 PM 2.5對(duì)HVSMCs遷移能力的影響

采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了PM2.5染毒對(duì)HVSMCs遷移能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PM2.5染毒組劃痕面積在24 h時(shí)明顯較對(duì)照組減小，計(jì)算各組劃痕愈合率發(fā)現(xiàn)PM2.5染毒組細(xì)胞劃痕愈合率較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05），見圖3A。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，PM2.5染毒后穿膜HVSMCs細(xì)胞數(shù)顯著增加，說(shuō)明PM2.5染毒后細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，與劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，見圖3B。同時(shí)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示12.5 mg/L濃度組對(duì)細(xì)胞遷移能力影響最強(qiáng)，因此選擇12.5 mg/L為最佳濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 PM 2.5對(duì)p38 MAPK磷酸化的影響

我們根據(jù)上述結(jié)果以12.5 mg/L的PM2.5染毒HVSMCs，用Western blot法檢測(cè)p38 MAPK的磷酸化水平，結(jié)果顯示PM2.5染毒后HVSMCs胞內(nèi)磷酸化p38 MAPK含量顯著增多，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.01），說(shuō)明PM2.5染毒可活化p38 MAPK信號(hào)分子；研究結(jié)果還顯示p38 MAPK的活化在染毒后20 min時(shí)最強(qiáng)，這其他研究者的結(jié)果相類似，一般認(rèn)為細(xì)胞受外界刺激后p38 MAPK激活較快且激活高峰往往出現(xiàn)在受刺激的早期，進(jìn)而引起細(xì)胞增殖和遷移等行為學(xué)改變［8］。本部分結(jié)果提示PM2.5活化HVSMCs可能與上調(diào)p38 MAPK蛋白磷酸化水平有關(guān)，見圖4。

Figure 3.The migration ability of HVSMCs induced by PM2.5 was detected by scratch assay and Transwell method.A：scratch wound healingassay（×40）；B：Transwell assay（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 PM 2.5對(duì)HVSMCs遷移能力的影響

Figure 4.The phosphorylation level of p38 MAPK in HVSMCs exposed to PM2.5 with or without SB203580 treatment.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs20 min group.圖4 PM2.5對(duì)p38 MAPK磷酸化的影響

4 p38 MAPK在PM 2.5激活HVSMCs中的作用

SB203580是p38 MAPK分子的特異性阻斷劑，我們用SB203580預(yù)處理HVSMCs，結(jié)果顯示SB203580預(yù)處理可以顯著降低PM2.5引起p38 MAPK磷酸化，見圖4。因此我們用SB203580為工具來(lái)處理細(xì)胞，觀察阻斷p38 MAPK后HVSMCs在PM2.5刺激下的增殖和遷移變化，以此來(lái)明確p38 MAPK信號(hào)分子在PM2.5影響HVSMCs中的作用。CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PM2.5單獨(dú)作用組比較，SB203580+PM2.5組細(xì)胞的增殖能力顯著降低，說(shuō)明阻斷p38 MAPK信號(hào)途徑降低了PM2.5促進(jìn)HVSMCs增殖的效果，見圖5A、B。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示，阻斷p38 MAPK信號(hào)后PM2.5對(duì)HVSMCs遷移能力的影響明顯減小，無(wú)論是劃痕愈合率還是穿膜細(xì)胞的比例，SB203580+PM2.5組均顯著低于PM2.5組（P＜0.05，P＜0.01），見圖5C、D。上述結(jié)果證實(shí)p38 MAPK信號(hào)途徑參與介導(dǎo)PM2.5促HVSMCs增殖和遷移過(guò)程。

討 論

Figure 5.The proliferation and migration ability of HVSMCs exposed to PM2.5 with or without SB203580 pre-treatment.A：the cell viability；B：EdU staining（scale bar=100μm）；C：scratch wound closure rate（×40）；D：the cell invasive rate detected by Transwell assay（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PM2.5 group.圖5 SB203580預(yù)處理對(duì)PM2.5促HVSMCs增殖和遷移的影響

2013年Adar等［9］通過(guò)對(duì)5 660人長(zhǎng)達(dá)2年半的觀察，發(fā)現(xiàn)PM2.5可加重動(dòng)脈中層硬化（AS的前期病變），而降低PM2.5濃度能減緩疾病的進(jìn)程，明確指出PM2.5可獨(dú)立致AS發(fā)生，其它多個(gè)研究也證實(shí)了該結(jié)論［1-3］。PM2.5已經(jīng)被公認(rèn)為是AS等心血管疾病的重要致病因子，對(duì)其致病機(jī)理的研究是目前的重點(diǎn)［1］。

HVSMCs被致病因子激活，細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng)是AS發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵性步驟和重要病理改變，然而PM2.5對(duì)HVSMCs的影響并不完全清楚［7，10］。本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng) HVSMCs，用 PM2.5直接染毒來(lái)觀察細(xì)胞增殖和遷移能力的變化。CCK-8法結(jié)果顯示在一定濃度范圍內(nèi)PM2.5染毒可明顯促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的活力，不同濃度PM2.5染毒組的細(xì)胞活力均顯著高于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)還采用EdU染色法對(duì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行了觀察，也得到了同樣的結(jié)果，證實(shí)PM2.5可促進(jìn)HVSMCs的增殖。本研究還通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PM2.5染毒也提高了血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力，并用Transwell實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)PM2.5影響HVSMC并無(wú)濃度依賴性，25 mg/L組細(xì)胞增殖和遷移能力低于12.5 mg/L組，這可能與隨著PM2.5濃度增高其非特異性細(xì)胞毒活性增強(qiáng)有關(guān)，以往也有研究發(fā)現(xiàn)在低濃度時(shí)PM2.5可促進(jìn)氣管平滑肌細(xì)胞的遷移，而高濃度時(shí)則引起細(xì)胞死亡［11］，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似，但是對(duì)于其具體原因尚需進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了在一定濃度范圍PM2.5染毒能激活血管平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移能力，證實(shí)PM2.5可能通過(guò)影響HVSMCs來(lái)促進(jìn)AS的發(fā)生。

p38 MAPK是絲裂原激活蛋白激酶超家族的重要成員，參與多種細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)傳遞，貫穿細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和死亡過(guò)程，特別在肌細(xì)胞分化中起著至關(guān)重要的作用［12］。研究顯示p38 MAPK被激活后進(jìn)入HVSMCs細(xì)胞核，催化絲/蘇氨酸磷酸化引起下游基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移［13］。多個(gè)研究證實(shí)激活p38 MAPK信號(hào)途徑是AS致病因子活化HVSMCs的主要方式之一，抑制p38 MAPK可阻止血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移［14-15］。因此，我們選擇p38 MAPK通路初步探討了PM2.5影響HVSMCs的作用機(jī)制，結(jié)果顯示PM2.5刺激后HVSMCs胞內(nèi)磷酸化p38 MAPK增多，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說(shuō)明PM2.5可激活p38 MAPK信號(hào)分子。本實(shí)驗(yàn)還選擇了不同時(shí)點(diǎn)來(lái)觀察p38 MAPK的活化情況，結(jié)果顯示PM2.5染毒20 min時(shí)對(duì)p38 MAPK的活化作用最為明顯。其它研究者在包括血管平滑肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞模型中也得到了類似的結(jié)果，并認(rèn)為致病因子激活p38 MAPK是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游事件，迅速激活的p38 MAPK轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)引起細(xì)胞增殖、遷移和炎癥因子表達(dá)等變化［8，16］。由于 PM2.5成分較為復(fù)雜，其可能通過(guò)與細(xì)胞膜受體結(jié)合或直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)等多種方式來(lái)激活p38 MAPK分子，我們將在后繼實(shí)驗(yàn)中分析并選取PM2.5的主要組分，對(duì)PM2.5激活p38 MAPK的具體途徑此進(jìn)行研究。

為了進(jìn)一步證實(shí)p38 MAPK活化與PM2.5引起的HVSMCs增殖和遷移的關(guān)系，我們用特異性信號(hào)分子阻斷劑SB203580預(yù)處理來(lái)阻斷p38 MAPK通路，然后觀察HVSMCs的增殖和遷移情況，結(jié)果顯示SB203580預(yù)處理可以抑制PM2.5誘導(dǎo)的p38MAPK活化，同時(shí)SB203580預(yù)處理組HVSMCs的增殖和遷移受到明顯抑制，通過(guò)上述兩方面的結(jié)果，本研究最終證實(shí)p38 MAPK介導(dǎo)了PM2.5誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移過(guò)程。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)大氣污染物中的PM2.5可以促進(jìn)HVSMCs細(xì)胞增殖和遷移能力，并證實(shí)p38 MAPK信號(hào)通路參與介導(dǎo)該過(guò)程，加深了對(duì)PM2.5的血管平滑肌細(xì)胞毒性及其致AS作用的認(rèn)識(shí)，后續(xù)本課題組將從PM2.5如何激活p38 MAPK等方面深入研究其致心血管疾病的機(jī)理。