秦 思，張 倩，王敬杰， 于 敏， 駱妍蓓， 丁 菁， 陸德琴

（貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025）

游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）是指非酯化的脂肪酸，作為機(jī)體的一種能量物質(zhì)，F(xiàn)FAs異常增高可引起脂類代謝異常和糖類代謝紊亂［1］，在高血壓和心力衰竭等心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）的發(fā)病過程中起著重要的作用［2-3］。FFAs中的飽和脂肪酸棕櫚酸（palmitate acid，PA）是人體內(nèi)含量最多的游離脂肪酸，參與肥胖、胰島素抵抗和高脂血癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展［4-6］。

內(nèi)皮功能障礙（endothelial dysfunction，ED）是CVD發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，其重要表現(xiàn)為一氧化氮（nitric oxide，NO）的生物利用度降低［7］，而內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的活性改變能影響NO的產(chǎn)量和利用度。血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性調(diào)節(jié)的一個分子機(jī)制是蛋白翻譯后修飾，而磷酸化調(diào)控是翻譯后修飾中重要的方式之一，在eNOS的磷酸化位點(diǎn)中Ser633的磷酸化水平增高可使該酶活性增強(qiáng)［8］，從而發(fā)揮血管保護(hù)作用，屬正性調(diào)節(jié)。已有研究表明，PA處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）后，eNOSSer1177磷酸化水平降低，eNOS活性降低，NO生成減少，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷［9-10］。也有研究者發(fā)現(xiàn)，用FFA中的油酸刺激HUVECs，可降低eNOSSer1177磷酸化水平和eNOS的活性，導(dǎo)致NO產(chǎn)生減少，最終導(dǎo)致ED［11］。但目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道PA是否對eNOSSer633磷酸化水平產(chǎn)生影響。

蛋白質(zhì)去磷酸化的過程由蛋白磷酸酶（protein phosphatase，PP）催化完成。本課題組前期研究結(jié)果表明血管緊張素 II（angiotensin II，Ang II）可激活蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）使eNOS Ser1177磷酸化水平降低［12-14］，然而迄今尚不明確能使eNOSSer633位點(diǎn)發(fā)生去磷酸化的蛋白磷酸酶。本研究在觀察PA引起HUVECs中eNOSSer633磷酸化水平降低的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探索是哪種蛋白磷酸酶在PA下調(diào)eNOSSer633磷酸化中發(fā)揮作用，旨在進(jìn)一步探討PA損害eNOS功能的分子機(jī)制，為闡明FFAs引起ED的發(fā)生機(jī)制提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 主要材料與儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由貴州醫(yī)科大學(xué)曾柱教授惠贈。無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)液和高糖DMEM培養(yǎng)液（HyClone）；胎牛血清（Biological Industries）；棕櫚酸和福司曲星（fostriecin，F(xiàn)ST）購自 Sigma；鼠抗人eNOS抗體和鼠抗人eNOSSer633抗體（BD）；兔抗鼠蛋白磷酸酶2A催化亞基（protein phosphatase 2A catalytic subunit，PP2Ac）抗體（Abcam）；鼠抗人PPX（PP4）抗體、PP4c siRNA及轉(zhuǎn)染試劑（Santa Cruz）；PP2Ac siRNA（中國上海吉瑪公司）；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000（Invitrogen）；鼠抗人β-tubulin抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠II抗及羊抗兔II抗（中國武漢普美克生物技術(shù)有限公司）；岡田酸（okadaic acid，OA）、NO熒光探針DAF-FM DA（中國碧云天公司）。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 體外培養(yǎng)HUVECs 用含10%胎牛血清FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下接種、培養(yǎng)HUVECs，每2 d更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取8～15代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 配制棕櫚酸 用20 mol/L HEPES（pH 7.0）配制0.1 mol/L氫氧化鈉，將PA溶于其中調(diào)節(jié)其濃度為60 mol/L，將PA與10%牛血清白蛋白以1∶9混合，配成終濃度為6 mol/L的PA貯存液，-20°C保存。

2.3 棕櫚酸處理HUVECs 分別用終濃度為25 μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的PA處理HUVECs 36 h，確定PA作用最佳濃度；另用100 μmol/L的PA分別處理細(xì)胞12 h、24 h、36 h和48 h，確定PA作用的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，根據(jù)結(jié)果后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用100μmol/L PA處理細(xì)胞36 h。

2.4 PP2A抑制劑預(yù)處理HUVECs 用DMSO配制20μmol/L FST和5μmol/L OA貯存液，-20℃保存。HUVECs用20 nmol/L FST預(yù)處理30 min，或5 nmol/L OA預(yù)處理30 min，再用100μmol/LPA處理36 h。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞內(nèi)NO含量檢測 將2μL熒光探針稀釋于1 mL無血清、無雙抗、不含酚紅的培養(yǎng)液中，HUVECs換用此培養(yǎng)液后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，然后用無血清、無雙抗、不含酚紅的培養(yǎng)液洗3次。倒置熒光顯微鏡觀察并拍照，采用ImageJ軟件分析熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3批次。

2.6 轉(zhuǎn)染siRNA 將HUVECs接種于6孔板中，密度達(dá)40%～50%轉(zhuǎn)染siRNA時(shí)細(xì)胞。嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書進(jìn)行。在1.5 mL無菌Ep管中先后加入不含血清和雙抗的培養(yǎng)液、80 pmol siRNA和8μL轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫下靜置25 min。棄去原有培養(yǎng)液，生理鹽水洗3次，將融合好的轉(zhuǎn)染液加入6孔板中，輕晃搖勻，于培養(yǎng)箱中孵育6 h后棄去轉(zhuǎn)染液，換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

2.7 Western blot檢測蛋白水平 收集細(xì)胞加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000×g離心25 min，取5μL上清液采用BCA法測定蛋白濃度，剩余上清液加入3×上樣緩沖液煮沸變性。經(jīng)10%SDSPAGE分離后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜3次后加入適當(dāng)比例稀釋的I抗，4°C孵育過夜，第2天加入HRP標(biāo)記的IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后，用ECL顯影后曝光。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集條帶圖像并分析條帶積分吸光度（A）值，結(jié)果以β-tubulin為內(nèi)參照，以目的條帶與內(nèi)參照條帶的積分吸光度值的比值表示。以上結(jié)果至少重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每批重復(fù)檢測3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS24.0軟件進(jìn)行分析，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊者兩兩比較采用SNK-q法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PA下調(diào)HUVECs內(nèi)eNOSSer633磷酸化水平

分別使用終濃度為25μmol/L、50μmol/L、100 μmol/L和200μmol/L的PA處理HUVECs 36 h，結(jié)果表明，與對照（control）組相比，PA處理后HUVECs內(nèi)eNOSSer633磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）；組間eNOS總蛋白表達(dá)無顯著差異，見圖1A。使用終濃度為100μmol/L PA分別處理HUVECs 12 h、24 h、36 h和48 h，結(jié)果表明，與control組相比，24 h、36 h和48 h組eNOS Ser633磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）；組間eNOS總蛋白表達(dá)無顯著差異，見圖1B。

2 PP2A家族抑制劑預(yù)處理上調(diào)eNOSSer633磷酸化水平

用PP2A家族抑制劑FST（20 nmol/L）或OA（5 nmol/L）預(yù)處理HUVECs 30 min，再用100 μmol/L PA處理細(xì)胞36 h，結(jié)果表明，與control組相比，PA組eNOSSer633磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)ST組與OA組eNOSSer633磷酸化水平無顯著差異；與PA組相比，F(xiàn)ST+PA組與OA+PA組eNOSSer633磷酸化水平均顯著增高（P＜0.05）；組間eNOS總蛋白表達(dá)無顯著差異，見圖2。

3 PP2A家族抑制劑預(yù)處理抑制PA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)NO產(chǎn)量減少

使用DAF-FM DA熒光探針檢測各組細(xì)胞內(nèi)NO產(chǎn)量，結(jié)果表明，與control組相比，PA組HUVECs內(nèi)熒光強(qiáng)度降低，NO產(chǎn)量顯著減少（P＜0.05），20 nmol/L FST處理組和5 nmol/L OA處理組熒光強(qiáng)度無顯著差異；與PA組相比，F(xiàn)ST+PA組和OA+PA組HUVECs熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)，NO產(chǎn)量顯著增多（P＜0.05），見圖3。

4 PP4對eNOSSer633磷酸化具有調(diào)控作用

在HUVECs中轉(zhuǎn)染PP4c特異性siRNA（si-PP4c），結(jié)果表明，與si-Control相比，si-PP4c組PP4c蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），eNOSSer633磷酸化水平顯著增高（P＜0.05），si-Control+PA組eNOSSer633磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；與si-PP4c組相比，si-PP4c+PA組eNOSSer633磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；與si-Control+PA組比，si-PP4c+PA組PP4c蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），eNOSSer633磷酸化水平顯著增高（P＜0.05）；組間eNOS總蛋白表達(dá)無顯著差異，見圖4A。

Figure 1.The levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs treated with palmitic acid（PA）.A：the levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs treated with different concentrations of PA for 36 h；B：the levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs treated with 100μmol/L PA for different time.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖1 棕櫚酸處理HUVECs后eNOS蛋白表達(dá)和eNOSSer633磷酸化水平的變化

Figure 2.The levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs pretreated with PP2A family inhibitor.A：the levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs pretreated with or without 20 nmol/L FSTfor 30 min and then treated with 100μmol/L PA for 36 h；B：the levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs pretreated with or without 5 nmol/L OA for 30 min and then treated with 100μmol/L PA for 36 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PA group.圖2 PP2A家族抑制劑預(yù)處理后HUVECs中eNOS蛋白表達(dá)和eNOSSer633磷酸化水平的變化

在HUVECs中轉(zhuǎn)染PP2Ac特異性siRNA（si-PP2Ac），結(jié)果表明，與 si-Control相比，si-PP2Ac組PP2Ac蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），eNOSSer633磷酸化水平無顯著變化，si-Control+PA組eNOSSer633磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；與si-PP2Ac組相比，si-PP2Ac+PA組eNOSSer633磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；與 si-Control+PA 組比，si-PP2Ac+PA 組PP2Ac蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），eNOSSer633磷酸化水平無顯著差異；組間eNOS總蛋白表達(dá)無顯著差異，見圖4B。

Figure 3.NOcontent in the HUVECs pretreated with PP2A family inhibitor.A：fluorescence map of each group（scale bar=50μm）；B：relative content of NOin each group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PA group.圖3 PP2A家族抑制劑預(yù)處理后細(xì)胞中NO產(chǎn)量的變化

討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO具有擴(kuò)張血管、抗炎、抗氧化損傷、抗凝和抗動脈粥樣硬化及抗細(xì)胞凋亡等生物學(xué)效應(yīng)，在維持心血管穩(wěn)態(tài)方面有重要作用［15-16］。內(nèi)皮細(xì)胞中的NO主要由eNOS的催化合成，eNOS基因缺失、表達(dá)減少以及活性降低都能使NO水平降低，促進(jìn)ED發(fā)生發(fā)展。研究已證實(shí)體內(nèi)FFAs升高可通過氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)和eNOS/NO途徑受損等導(dǎo)致內(nèi)皮功能發(fā)生障礙［17-18］，降低FFAs可能對心血管疾病具有一定防治作用［19］。有研究報(bào)道［9-10］PA 處理 HUVECs后，eNOS Ser1177磷酸化水平降低，然而PA是否引起內(nèi)皮細(xì)胞eNOSSer633磷酸化水平HUVECs內(nèi)變化尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察到PA處理HUVECs后呈濃度依賴地降低HUVECs內(nèi)eNOSSer633磷酸化水平，100μmol/L PA處理HUVECs 36 h時(shí)eNOSSer633磷酸化水平降低至50%左右，進(jìn)一步用100μmol/L PA處理細(xì)胞不同時(shí)間，24 h、36 h和48 h組eNOSSer633磷酸化水平均有降低，其中36 h組eNOSSer633磷酸化水平降低至約50%。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用熒光探針檢測細(xì)胞中NO產(chǎn)量，PA組NO產(chǎn)量明顯降低，與文獻(xiàn)［9-10］結(jié)果一致，即PA可以減少NO生成。但PA引起eNOSSer633磷酸化水平降低的分子機(jī)制尚不清楚。

血管內(nèi)皮細(xì)胞中PP2A對eNOS的磷酸化修飾有重要調(diào)控作用，體內(nèi)外研究已證明AngII可激活PP2A使eNOSSer1177去磷酸化，降低eNOS的活性，從而減少NO生成，導(dǎo)致ED［12-14］。PP2A能否使eNOS Ser633去磷酸化需要進(jìn)一步研究。PP2A家族包括PP2A、蛋白磷酸酶4（protein phosphatase 4，PP4）和蛋白磷酸酶6（protein phosphatase 6，PP6），在多種病理生理過程中起著重要的作用，其中PP4與PP2A有65%的氨基酸同源［20］。本研究觀察到PA處理HUVECs后eNOSSer633磷酸化水平降低，進(jìn)一步使用PP2A家族抑制劑FST 20 nmol/L或OA 5 nmol/L預(yù)處理HUVECs后觀察到eNOSSer633磷酸化水平增高。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道FST（20 nmol/L）對PP4的抑制作用與PP2A相似［21］，低劑量OA（5 nmol/L）對PP2A和PP4都有抑制作用［22］，因此推測PA可能通過激活PP4和（或）PP2A導(dǎo)致eNOSSer633磷酸化水平降低。由于PP2A家族成員的結(jié)構(gòu)相似，對其功能研究使用抑制劑難以確定某個磷酸酶的作用，因此尚不確定究竟是PP2A還是PP4發(fā)揮作用。

Figure 4.The levels of total eNOSprotein and eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs transfected with PP4c siRNA or PP2Ac siRNA.A：the levels of PP4c，eNOSand eNOSSer633 phosphorylation in the HUVECs transfected with PP4c siRNA；B：the levels of PP2Ac，eNOS protein and eNOS Ser633 phosphorylation in the HUVECs transfected with PP2Ac siRNA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-Control group；△P＜0.05 vs si-PP4c group；#P＜0.05 vs si-PP2Ac group；★P＜0.05 vs si-Control+PA group.圖4 敲減PP4c和PP2Ac后eNOS蛋白表達(dá)和eNOSSer633磷酸化水平的變化

PP4由催化亞基PP4c和4種調(diào)節(jié)亞基PP4R1、PP4R2、PP4R3及PP4R4構(gòu)成，催化亞基和不同的調(diào)節(jié)亞基組合成多種不同的二聚體或三聚體PP4全酶，參與許多重要的細(xì)胞過程［23］。PP2A是一種異源三聚體蛋白復(fù)合物，由催化亞基PP2Ac和結(jié)構(gòu)亞基A形成二聚體再與調(diào)節(jié)亞基B形成不同的異源三聚體［23］。本實(shí)驗(yàn)采用 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，在HUVECs內(nèi)轉(zhuǎn)染PP4c亞基或PP2Ac亞基特異性siRNA，抑制PP4c或PP2Ac蛋白表達(dá)水平，從而降低PP4和PP2A活性，進(jìn)一步明確是哪一種蛋白磷酸酶發(fā)揮作用。結(jié)果顯示，敲減PP4c表達(dá)后，eNOSSer633磷酸化水平顯著上調(diào)，而敲減PP2Ac表達(dá)后，eNOSSer633磷酸化水平無顯著變化，提示PA有可能通過激活PP2A家族中PP4而不是PP2A降低eNOSSer633磷酸化水平。

綜上所述，在HUVECs中，PA可能通過激活PP4而不是PP2A引起eNOSSer633水平降低，NO產(chǎn)量減少。本研究報(bào)道了PP4對eNOSSer633的磷酸化調(diào)控作用，但PP4調(diào)控eNOSSer633磷酸化的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。