白 雪， 于 慧， 朱菊茹， 韓忠麗， 楊曉敏△

（1包頭醫(yī)學(xué)院研究生院，內(nèi)蒙古包頭014040；2包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭014030）

由Rullber等［1］學(xué)者首次于1972年通過尸檢證實(shí)的糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是一種獨(dú)立于高血壓、冠心病之外的特異性心肌病，是糖尿病患者心力衰竭高發(fā)生率和高死亡率的因素之一［2］。DCM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，高血糖在DCM的發(fā)生進(jìn)展中起著重要的作用［3-4］，不論是在糖尿病的動(dòng)物模型或糖尿病臨床研究中，都證實(shí)了糖尿病會(huì)增加心肌細(xì)胞的凋亡［5-6］。但高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制研究尚不明確。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，Rho相關(guān)卷曲螺旋激酶（Rhoassociated coiled-coil kinase，ROCK）與心肌損傷、心肌細(xì)胞的凋亡及心力衰竭相關(guān)［7］。在糖尿病動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)或體外心肌細(xì)胞研究中，抑制Rho激酶的激活或者下調(diào)ROCK的表達(dá)，都會(huì)抑制病理刺激下的心肌細(xì)胞的凋亡［8-9］。有研究報(bào)道，DCM的發(fā)病進(jìn)程與蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信號通路的失活有關(guān)［10-11］。激活磷酯酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt信號通路可以保護(hù)心肌細(xì)胞對抗高糖引起的氧化應(yīng)激和炎癥因子刺激，從而提高細(xì)胞存活率［12］。ROCK 與 PI3K/Akt信號通路之間是否存在相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制從而介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡將是本研究的重點(diǎn)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器和試劑

Wistar大鼠乳鼠（出生1～3 d）購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號為［SCXK（京）2014-0004］；低糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、Ⅱ型膠原酶和5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）購自Gibco；抗α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白（α-sarcomeric actin，α-SCA）免疫組化試劑盒購自武漢博士德；葡萄糖和DMSO購自Sigma；MTT購自北京博奧拓；TRIzol試劑購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑和RT-qPCR試劑購自TaKaRa；引物由上海生工合成；ROCK抑制劑Y27632購自MCE；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BD；蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑購自Thermo；兔抗大鼠 ROCK1、ROCK2、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、PI3K、Akt和p-Akt抗體及山羊抗兔Ⅱ抗購自Cell Signaling Technology；ECL發(fā)光液購自Thermo。多功能臺式高速離心機(jī)5805R購自Eppendorf；二氧化碳培養(yǎng)箱購自Thermo；酶標(biāo)儀購自Bio-Rad iMark；紫外分光光度計(jì)TU-1900購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CantoⅡ流式細(xì)胞儀購自BD；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自Applied Biosytems；小型垂直電泳儀和XRS+S化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自Bio-Rad。

2 方法

2.1 原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 取出生1～3 d的Wistar乳大鼠10只，雌雄不限，無菌操作取出心臟在不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中洗3次，取心臟靠近心尖部的2/3部分，并剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊。采用單一膠原酶短時(shí)多次消化法消化心肌細(xì)胞，即使用0.6 g/L的Ⅱ型膠原酶4.5 mL消化10 min，在37℃水浴鍋中共消化10次棄去首次消化液，用含15%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液終止消化。收集細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min，棄掉上清，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，經(jīng)200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁90 min。差速貼壁去除成纖維細(xì)胞之后以5～8×105密度鋪于24孔中，或者以每孔1.5～2.0×106密度鋪于6孔板中，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。鋪板時(shí)每孔需加入0.1 mmol/L的BrdU抑制成纖維細(xì)胞的生長，24 h后換液。心肌細(xì)胞免疫組化的鑒定采用橫紋肌肌動(dòng)蛋白兔來源抗體。細(xì)胞鋪板前放置細(xì)胞爬片，細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)48 h后，取出爬片，1×PBS洗去殘留的血清及培養(yǎng)基，用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min，1×PBS漂洗，0.1%的Triton X-100通透15 min，后經(jīng)內(nèi)源性過氧化物酶滅活，5%BSA液封閉，α-SCAⅠ抗以1∶100孵育，濕盒4℃過夜后加羊來源的Ⅱ抗孵育，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片后顯微鏡拍照。

2.2 心肌細(xì)胞高糖模型的制備及培養(yǎng)條件 細(xì)胞在含10%胎牛血清的低糖DMEM中培養(yǎng)48 h后，換成含1%胎牛血清的DMEM饑餓24 h，之后分別采用含糖5.5、33和40 mmol/L的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR、流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測和Western blot實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ROCK對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用，將培養(yǎng)48 h后的原代心肌細(xì)胞分為正常糖（normal glucose，NG）對照組（含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞）、高糖（high glucose，HG）組（含葡萄糖33 mmol/L）和HG+Y27632組（心肌細(xì)胞在濃度為10μmol/L的Y27632培養(yǎng)30 min后，換為含葡萄糖33 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基）。3組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行RT-qPCR及Western blot檢測相關(guān)基因mRNA和蛋白水平的變化。

2.3 MTT法檢測心肌細(xì)胞活力 心肌細(xì)胞消化好后計(jì)數(shù)，稀釋后以每孔200μL的體積加入到96孔板中，保證細(xì)胞數(shù)量在103～104之間，空白調(diào)零孔只加不含細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每個(gè)孔中加入5 g/L的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去孔中所有液體，吸干凈后，加入150μL DMSO，室溫?fù)u床搖10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測490 nm處吸光度（A）。細(xì)胞相對活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 棄去各組原有培養(yǎng)液，用預(yù)冷的1×PBS洗滌后收集細(xì)胞，再用不含EDTA的胰酶消化收集上述3組細(xì)胞，用含15%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，收集各組孔板所有液體1 000 r/min離心5 min，棄掉上清后用1×PBS洗滌細(xì)胞2次，再加入500μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，之后加入Annexin V-FITC 5μL染色15 min，上機(jī)前加入PI染液5μL染色5 min，最后在流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

2.5 RT-qPCR檢測ROCK1和ROCK2的mRNA表達(dá) 每組細(xì)胞造模后（每組設(shè)置3個(gè)平行孔），采用TRIzol直接裂解法提取每組細(xì)胞的總RNA。使用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的純度和濃度，待測RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之間，使用相對定量比較Ct法對ROCK1和ROCK2的表達(dá)水平進(jìn)行定量。采用TaKaRa的PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照產(chǎn)品說明書步驟操作，采用20μL反應(yīng)體系：5×Prime-Script RT Master Mix 4μL，總RNA不超過1 000 ng，最后加RNase-free dH2O至20μL。反應(yīng)條件為：37℃ 15 min、85℃ 5 s，置于4℃。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增采用TaKaRa的TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑，以β-actin作為內(nèi)參照。ROCK1的上游引物序列為5′-TATGAAGTAGTAAAGGTAATCGGCAGAG-3′，下游引物序列為 5′-CTGGTGGATTTATGCCTTACCAA-3′；ROCK2 的 上游引物序列為5′-AATCAAATCAGCATCCTTCTTTAAGAAT-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CTGGAGCTGCCGTCTCTCTTAT-3′［13］；β-actin 的上游引物為 5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，下 游 引 物 為CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′。 按 照 說 明書采取20μL反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus 2×）10 μL，PCR Forward Primer（10μmol/L）0.8μL，PCR Reverse Primer（10μmol/L）0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，DNA模板2μL，滅菌水6μL。置于ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃30 s、95℃ 5 s、60℃ 34 s；95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算ROCK1和ROCK2的相對表達(dá)量［14］。

2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 棄去6孔板細(xì)胞原有的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的1×PBS洗1遍，按照細(xì)胞量每孔加入200μL的M-PER哺乳動(dòng)物細(xì)胞總蛋白裂解液（Thermo），冰上搖晃裂解10 min，收集裂解液以14 000×g離心力離心10 min，收集上清，用BCA法測定蛋白濃度，取20μg進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，然后進(jìn)行PVDF膜濕轉(zhuǎn)（100 V、90 min），5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，分別加入待測蛋白和內(nèi)參照β-actin的I抗，4℃過夜，1×TBST洗3次，加入II抗，室溫孵育2 h，1×TBST洗3次，凝膠成像儀中曝光拍照，ImageJ軟件分析蛋白灰度值，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)屬于完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的計(jì)量資料，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 原代心肌細(xì)胞形態(tài)

倒置顯微鏡下觀察可見，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后已基本貼壁，培養(yǎng)48 h后細(xì)胞搏動(dòng)明顯，平均每分鐘搏動(dòng)85±7次，呈典型的梭型狀，細(xì)胞有偽足生出，部分細(xì)胞呈團(tuán)簇狀生長，立體感十分明顯，收縮強(qiáng)勁有力。如圖1所見，免疫組化原代心肌細(xì)胞純度達(dá)95%。

Figure 1.Micrograph of rat neonatal cardiomyocytes cultured for 48 h.The scale bar=50μm.圖1 培養(yǎng)48 h后的原代心肌細(xì)胞形態(tài)

2 MTT檢測不同組細(xì)胞活力的結(jié)果

按5.5 mmol/L組的細(xì)胞活力為100%，則33 mmol/L組的細(xì)胞相對活力為（79.71±2.43）%，40 mmol/L組的細(xì)胞相對活力為（68.41±7.49）%，較5.5 mmol/L組顯著降低（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.The changes of the A value in the cardiomyocytes exposed to high glucose for 48 h measured by MTT assay.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 5.5 mmol/L group.圖2 不同組細(xì)胞48 h后細(xì)胞活力的變化

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測每組細(xì)胞凋亡率的結(jié)果

33和40 mmol/L高糖刺激細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率較對照組顯著增加（P＜0.05），見圖3。

4 RT-qPCR檢測ROCK1和ROCK2的mRNA表達(dá)

33和40 mmol/L高糖刺激48 h后，ROCK1和ROCK2的mRNA表達(dá)較對照組顯著增加（P＜0.05），見圖4。

Figure 3.The changes of apoptotic rates in the cardiomyocytes exposed to high glucose for 48 h were detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs5.5 mmol/L group.圖3 高糖作用48 h后細(xì)胞凋亡率的變化

5 Western blot檢測蛋白水平的變化

33和40 mmol/L高糖作用48 h后，ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)較對照組顯著升高（P＜0.05），見圖5。

與對照組相比，33和40 mmol/L高糖作用48 h后原代心肌細(xì)胞的凋亡蛋白cleaved caspase-3的水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖6。

33和40 mmol/L高糖作用48 h后，PI3K與Akt蛋白水平較對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，p-Akt的蛋白水平則較對照組顯著降低（P＜0.05），表明高糖可使Akt的活化受到抑制，見圖7。

Figure 4.The mRNA expression of ROCK1 and ROCK2 in the 3 groups was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs5.5 mmol/L group.圖4 高糖作用48 h后ROCK 1與ROCK 2的mRNA表達(dá)變化

Figure 5.Western blot was used to determine the protein expression of ROCK1 and ROCK2 in the cardiomyocytes exposed to high glucose for 48 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs5.5 mmol/L group.圖5 高糖作用48 h后ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)的變化

Figure 6.Western blot was used to determine the protein levels of cleaved caspase-3 and Bcl-2 in the cardiomyocytes exposed to high glucosefor 48 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs5.5 mmol/L group.圖6 高糖作用48 h后cleaved caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)的變化

此外，在ROCK抑制劑實(shí)驗(yàn)部分，與對照組相比，高糖組ROCK1和ROCK2蛋白的表達(dá)增高（P＜0.05），HG+Y27632組的ROCK1和ROCK2蛋白不表達(dá)，見圖8；3組間PI3K與AKT蛋白水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），而與對照組相比，高糖組p-Akt蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），HG+Y27632組p-Akt的蛋白水平較高糖組顯著增加（P＜0.05），見圖9。

討 論

Figure 7.Western blot was used to determine the protein levels of PI3K，Akt and p-Akt in the cardiomyocytes exposed to high glucose for 48 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs5.5 mmol/L group.圖7 高糖作用48 h后PI3K、Akt和p-Akt蛋白水平的變化

Figure 9. Western blot analysis was used to deternmine the protein levels of PI3K,Akt and p-Akt in the cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NGgroup;#P＜0.05 vs HGgroup.圖9 ROCK抑制劑對PI3K、Akt和p-Akt蛋白水平的影響

越來越多的研究表明，高血糖在DCM的發(fā)病中扮演了重要角色，但高血糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的分子機(jī)制尚不清楚。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，活化的ROCK通過與肌球蛋白輕鏈的磷酸化而活化促進(jìn)細(xì)胞收縮和附著以增加肌球蛋白ATP酶的活性［15］，通過調(diào)控信號元件，如Bcl-2的激活，死亡受體的激活，caspase的活化等誘導(dǎo)多種細(xì)胞的凋亡［16-17］。近年來有研究證實(shí)，冠心病引起的心力衰竭伴隨心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生［18］，有研究顯示糖尿病患者的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量是健康人群的85倍，心肌細(xì)胞的凋亡是DCM的重要發(fā)病機(jī)制［19-20］。過度活化ROCK會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，阻斷ROCK的表達(dá)亦可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生［21］。ROCKs可以被caspase-3激活，介導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡，ROCK是活化的caspase-3的直接裂解產(chǎn)物，激活的ROCK又反饋激活caspase-3，形成一個(gè)惡性循環(huán)［22］。

本研究發(fā)現(xiàn)，高糖作用48 h后，cleaved caspase-3蛋白量增加，且細(xì)胞凋亡率增加。cleaved caspase-3蛋白為一對分子量為17 kD的caspase-3活性亞單位，一般認(rèn)為，當(dāng)細(xì)胞被凋亡信號激活時(shí)，無活性的caspase-3酶原被裂解為有活性的cleaved caspase-3，標(biāo)志著凋亡過程進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)階段［23］。RT-qPCR和Western blot分別對ROCK1和ROCK2 mRNA和蛋白進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高糖組ROCK1和ROCK2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，證明高糖作用激活了ROCK1和ROCK2的表達(dá)，可能參與了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這與之前的研究結(jié)果一致［24-25］。

PI3K/Akt通路是PI3K始動(dòng)的生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡啟動(dòng)、血管生成等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PI3K/Akt信號通路通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的活性和表達(dá)量在促進(jìn)細(xì)胞存活方面具有重要作用［26-27］。第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）是一種能夠使蛋白質(zhì)和磷酸肌醇底物去磷酸化的磷酸酶，它是PI3K上游的一個(gè)負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，它可以使三磷酸磷脂酰肌醇脫磷酸生成二磷酸磷脂酰肌醇，進(jìn)而下調(diào)PI3K/Akt通路蛋白的表達(dá)加速細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生存［28-29］。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，高糖可使Akt磷酸化水平及Bcl-2的表達(dá)降低，說明高糖引起PI3K/Akt信號通路的抑制，使抗凋亡蛋白表達(dá)降低，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

為了進(jìn)一步證實(shí)ROCK對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用，我們在高糖作用的細(xì)胞中，加入ROCK抑制劑Y27632。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高糖組ROCK1和ROCK2表達(dá)顯著增高，高糖組加Y27632組，ROCK1/2表達(dá)被抑制，同時(shí)，p-Akt的蛋白水平顯著升高。

有研究證實(shí)，ROCK的過表達(dá)可磷酸化PTEN直接使其激活，增加了PTEN的活性及其蛋白的穩(wěn)定性。因此，我們認(rèn)為，高糖可能是通過激活ROCK，導(dǎo)致PTEN活性增強(qiáng)，進(jìn)一步通過抑制Akt蛋白磷酸化，抑制了PI3K/Akt信號通路的活性，引起下游一系列凋亡蛋白的表達(dá)增加，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。針對缺血缺氧模型的研究顯示，ROCK在缺氧狀態(tài)下被激活，凋亡也隨之發(fā)生，在缺氧狀態(tài)下，PI3K/Akt信號通路的表達(dá)是失活的［30］。Yu 等［31］的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過激活PI3K/AKT信號保護(hù)心肌細(xì)胞對抗高糖高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，均與我們的研究結(jié)果一致。

綜上所述，ROCK1/2參與了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的過程，其機(jī)制可能是抑制Akt的磷酸化，從而抑制PI3K/Akt信號通路的激活，引起下游一系列凋亡蛋白增加有關(guān)。