高鋒 陳麗秀 朱于娟 陳敏潔 許梅杰 張潔如 錢文霞

由于煙草、大氣污染等因素的影響，近年來肺癌的發(fā)病率顯著上升，GLOBOCAN2018報(bào)告顯示：2018年全球肺癌新發(fā)病例約209萬，死亡約176萬，占惡性腫瘤新發(fā)病例及死亡病例的11.6%及18.4%，位居惡性腫瘤之首[1]。深入了解肺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)臨床治療、改善肺癌患者生存率具有重要價(jià)值。CD73，即5′胞外核苷酸酶，是參與胞外腺苷酸轉(zhuǎn)化為腺苷的生物學(xué)過程的關(guān)鍵酶，是腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制因子，在腫瘤的免疫逃逸、侵襲轉(zhuǎn)移有重要意義[2]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)是具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，參與腫瘤的免疫逃逸、促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)其與多種惡性腫瘤相關(guān)，如胃癌、胰腺癌等[3]，叉頭狀核轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)在Treg細(xì)胞呈特異性表達(dá)，通過檢測(cè)Foxp3表達(dá)可以有效提示Treg細(xì)胞數(shù)量。本研究旨在通過采用免疫組化SP法分析CD73與Foxp3+Treg細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)，了解非小細(xì)胞肺癌浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移過程中的可能機(jī)制，以期能形成新的腫瘤標(biāo)志物，更好的監(jiān)測(cè)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展與判斷預(yù)后。

資料與方法

一、臨床資料

本研究選取2012年01月至2013年12月術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本70例，10例癌旁正常肺組織設(shè)為對(duì)照組，入組患者無其他惡性腫瘤及術(shù)后化療病史。其中女性32例，男性38例，平均年齡 63.18±7.59歲，鱗癌33例，腺癌37例，低分化27例，中高分化43例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，參考第8版UICC TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期21例，Ⅱ期35例，Ⅲ期14例。該研究經(jīng)由蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

二、主要實(shí)驗(yàn)試劑

SP檢測(cè)試劑盒購自福州邁新公司，CD73、Foxp3兔抗人多克隆抗體購自武漢三鷹公司。

三、實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照(以PBS代替一抗)。所有標(biāo)本均適當(dāng)取材、及時(shí)固定、石蠟包埋，3um層厚完整切片，常規(guī)脫蠟及水化，EDTA抗原修復(fù)，過氧化酶溶液阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性，采用山羊血清封閉，加用一抗在4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，順序滴加生物素標(biāo)記的二抗及鏈霉素抗生物素——過氧化酶溶液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封閉，顯微鏡下觀察。

四、陽性結(jié)果判定

CD73染色結(jié)果參考Al-Shibli[4]標(biāo)準(zhǔn)。以肺癌細(xì)胞細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯染色的棕黃色顆粒為陽性，觀察五個(gè)高倍視野(×400倍)，根據(jù)陽性細(xì)胞率計(jì)分：0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為陽性細(xì)胞11%～50%，3分為陽性細(xì)胞51～75%為3分，4分為陽性細(xì)胞>75%；根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分，陽性細(xì)胞率與染色強(qiáng)度乘積在3分以上為陽性。Foxp3定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，隨機(jī)觀察每張切片的五個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比及平均值，將陽性細(xì)胞百分比<5%定為表達(dá)陰性，≥5%定為表達(dá)陽性。

五、隨訪

70病例均有完整的隨訪資料，采用電話形式進(jìn)行隨訪。隨訪截止日期為2018年12月。生存期的計(jì)算從手術(shù)日期至隨訪截止日期或死亡日期為止。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用率表示，采用卡方檢驗(yàn)分析CD73與Treg細(xì)胞在不同肺組織的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析。采用 Kaplan-Meier分析CD73、Treg細(xì)胞與生存期的關(guān)系，Cox回歸多因素生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CD73在不同肺組織中的表達(dá)

CD73在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)分布和陽性顆粒沉淀位置主要是以胞膜型為主，根據(jù)陽性染色細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度將染色結(jié)果分為四個(gè)等級(jí)：強(qiáng)陽性、中等陽性、弱陽性、陰性，CD73在10例癌旁正常肺組織中無表達(dá)表達(dá)，陽性表達(dá)率為0%(0/10)，CD73在70例腺癌及鱗癌中呈陽性表達(dá)率為73.7%(53/70)，肺癌組與癌旁正常肺組織比較，CD73表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表1，圖1～6)。

表1 CD73在不同肺組織中的表達(dá)

二、CD73的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

70例肺癌組織中，TNM分期高、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其CD73陽性表達(dá)率明顯高，與CD73陰性表達(dá)者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CD73的表達(dá)與年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度無關(guān)(P>0.05)(見表2)。

三、Foxp3+Treg細(xì)胞在不同肺組織中的表達(dá)

Foxp3陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒，定位于淋巴細(xì)胞細(xì)胞核，F(xiàn)oxp3標(biāo)記的Treg細(xì)胞在10例癌旁正常肺組織中無表達(dá)表達(dá)或僅有微弱表達(dá)，陽性表達(dá)率為0%(0/10)，而在70例肺癌間質(zhì)內(nèi)49例可見陽性浸潤(rùn)表達(dá)，陽性表達(dá)率為70%(49/70)，肺癌組與癌旁正常肺組織比較，F(xiàn)oxp3標(biāo)記的Treg細(xì)胞浸潤(rùn)分布的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表3、圖7、8)。

表2 CD73的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表3 Foxp3+Treg細(xì)胞在不同肺組織中的表達(dá)

四、Foxp3+Treg細(xì)胞與臨床病理特征的關(guān)系

70例肺癌組織中，TNM分期高與存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的Foxp3+Treg細(xì)胞在間質(zhì)內(nèi)的浸潤(rùn)數(shù)量明顯增加，陽性表達(dá)率明顯升高，與Foxp3+Treg細(xì)胞陰性表達(dá)者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)與年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度無關(guān)(P>0.05)(見表4)。

五、CD73與Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)相關(guān)性分析

70例肺癌組織中，CD73的陽性表達(dá)與Foxp3+Treg細(xì)胞在肺癌間質(zhì)內(nèi)的陽性浸潤(rùn)呈正相關(guān)(r=0.284，P<0.05)(見表5)。

圖1 C達(dá)(×400) 圖2 CD73在肺腺癌中中等陽性表達(dá)(×100) 圖3 CD73在肺腺癌中強(qiáng)陽性表達(dá)(×100) 圖4 CD73在肺鱗癌中弱陽性表達(dá)(×400) 圖5 CD73在肺鱗癌中中等陽性表達(dá)(×400) 圖6 CD73在肺鱗癌中強(qiáng)陽性表達(dá)(×400) 圖7 Foxp3+Treg細(xì)胞在肺鱗癌中陽性表達(dá)(×200) 圖8 Foxp3+Treg細(xì)胞在肺腺癌中陽性表達(dá)(×200)

六、CD73與Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存曲線分析提示在70例非小細(xì)胞肺癌中，CD73陰性表達(dá)組患者中位生存期(58.00±5.65月)明顯優(yōu)于陽性表達(dá)組患者(32.00±1.55月)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Foxp3+Treg細(xì)胞陰性表達(dá)組患者中位生存期(58.00±4.57月)與陽性表達(dá)組(32.00±1.16月)相比，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。單因素分析提示患者預(yù)后與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞分化程度、TNM分期、CD73與Foxp3+Treg細(xì)胞的陽性表達(dá)密切相關(guān)。Cox回歸多因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、CD73與Foxp3+Treg細(xì)胞的陽性表達(dá)密切相關(guān)(P<0.05)。分析結(jié)果提示CD73與Foxp3+Treg細(xì)胞是判斷患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(見圖9、10、表6、7)。

表4 Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表5 CD73與Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性

圖9 CD73與生存期

圖10 Foxp3+Treg細(xì)胞與生存期

討 論

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，具有高患病率及高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類的生命健康，其中約85%為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[5]。近年來，由于煙草、大氣污染等因素的影響，NSCLC的患病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，其治療也面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。由于NSCLC發(fā)病隱匿、早期缺乏典型癥狀且具有侵襲轉(zhuǎn)移力強(qiáng)、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，多數(shù)患者確診時(shí)已錯(cuò)過最佳治療時(shí)期,其5年的生存率僅為17%[6]，因此探索NSCLC發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對(duì)于指導(dǎo)患者早期診療、開發(fā)新的靶點(diǎn)治療以及改善患者預(yù)后具有十分重要的意義。

表6 非小細(xì)胞肺癌生存期相關(guān)因素單因素分析

表7 非小細(xì)胞肺癌生存相關(guān)因素Cox回歸多因素分析

綜上所述，NSCLC的發(fā)生一個(gè)多種因素影響、多種環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜過程，早期發(fā)現(xiàn)與診斷肺癌是改善患者預(yù)后的重要措施，通過本研究結(jié)果提示CD73、Foxp3+Treg細(xì)胞參與了NSCLC的進(jìn)展過程，CD73、Foxp3+Treg細(xì)胞可能成為監(jiān)測(cè)NSCLC病情變化的新型標(biāo)志物及腫瘤防治的新突破口，形成肺癌精準(zhǔn)治療的新途徑，從而有效改善患者預(yù)后。