徐曼，次曉蕊，呂媛媛，張娟娟，3，管敏鑫

（1.溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院生命科學學院Attardi線粒體生物醫(yī)學研究院，浙江溫州325035；2.寧波醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院檢驗科，浙江寧波315040；3.溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院科研中心，浙江溫州325027）

Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber’shereditaryopticneuropathy，LHON）是一種由于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及其軸索受到病理性損傷而導致的母系遺傳性眼病[1]。臨床主要表現(xiàn)為雙眼同時或先后、急性或亞急性無痛性視力損傷，同時可伴有中心視野缺失及色覺障礙，青壯年男性好發(fā)[2-3]。線粒體DNA（mtDNA）突變是LHON的分子基礎，MT-ND411778G＞A，MT-ND614484T＞C和MT-ND13460G＞A為LHON的3個原發(fā)突變，在白種人中，90%以上LHON患者攜帶3種原發(fā)突變之一[4]，而3個原發(fā)突變約占中國LHON家系的50%[5-7]。線粒體tRNA突變（tRNAMet4435A＞G，tRNAGlu14693A＞G和tRNAThr15951A＞G突變）協(xié)同3個原發(fā)突變增加LHON的外顯率和表現(xiàn)度[8-10]。線粒體tRNA突變使tRNA的結構和功能受到影響，使得tRNA代謝功能缺陷，線粒體的翻譯和呼吸功能異常，導致線粒體ATP產(chǎn)量降低，ROS產(chǎn)生增加，影響對線粒體依賴性較高的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，導致LHON的發(fā)生[1，11]。線粒體tRNAPhe593T＞C突變可能增強攜帶m.11778G＞A突變的中國LHON家系的外顯率[12]。為進一步研究線粒體tRNAPhe593T＞C突變是否影響攜帶其他2個原發(fā)突變的中國LHON家系的外顯率和表現(xiàn)度，本研究對收集的742例中國漢族LHON患者進行了線粒體全基因組測序，發(fā)現(xiàn)18個攜帶tRNAPhe593T＞C突變的LHON家系，并對其中4個家系進行進一步分析。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2004年4月至2019年9月，課題組收集的全國各地多家醫(yī)院的LHON患者742例，經(jīng)溫州醫(yī)科大學倫理委員會的許可，在所有受檢者簽署知情同意書的情況下，采集血樣并且收集相關臨床資料。同時，采集376名中國正常人血樣作為對照。對收集的742例漢族LHON患者進行線粒體全基因組測序，發(fā)現(xiàn)18個攜帶tRNAPhe593T＞C突變的LHON家系（對照組中只有1個攜帶此突變的家系），并對其中4個家系進行進一步分析。

1.2 方法

1.2.1 眼科臨床檢查：對家系先證者和其他成員進行眼科臨床檢查，包括視力、視野、色覺、眼位、眼壓、眼底、瞳孔對光反射、視覺誘發(fā)電位（visualevokedpotential，VEP）、眼底成像等。WHO定義的視力損傷程度的標準：輕度：0.3～0.1；中度：0.1～0.05；重度：0.05～0.02；極重度：小于0.02。

1.2.2 線粒體基因組突變分析：采集4 個家系先證者及其他母系成員外周靜脈血經(jīng)EDTA-K3抗凝后，用經(jīng)典的苯酚/氯仿法手工提取基因組總DNA（內(nèi)含線粒體DNA），再對提取的基因組DNA用紫外分光光度計進行濃度和純度檢測（NanoDrop2000，美國ThermoFisher公司），以提取的DNA作為PCR擴增的模板進行擴增反應。在1%的瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定后，將產(chǎn)物送至杭州擎科生物科技有限公司對線粒體基因組進行全序列測序。最后，測序結果由DNASTAR等軟件并與修正的劍橋參考序列（therevisedCambridgeReferenceSequence，rCRS，NC_012920.1）[13]進行比對分析。

1.2.3 線粒體單體型分析：4 個家系先證者的測序結果經(jīng)DNASTAR軟件分析后，找出全序中所有突變位點。再根據(jù)mtDNAtreeBuild17（18Feb2016）（http：//www.phylotree.org）中的rCRS進行比對，確定各自的線粒體單體型。

1.2.4 tRNA結構分析：根據(jù)tRNAPhe的序列和存在m.593T＞C突變的tRNAPhe序列，在Mathewslab：ComputationalBiologyofRNA.（http：//rna.urmc.rochester.edu/）中，經(jīng)以下四個算法進行二級結構預測：①Partition，對單個序列進行配分函數(shù)計算，計算堿基對概率；②Fold，預測序列的一組低自由能結構中的最低自由能結構；③MaxExpect，生成一個或多個由高度可能堿基對組成的結構；④ProbKnot，預測可能堿基對的二級結構。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計病例組和對照組中攜帶m.593T＞C突變的例數(shù)，以χ2檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 樣本篩查 通過對收集的742個中國漢族LHON患者和376 個正常人對照進行篩查，發(fā)現(xiàn)18 個攜帶m.593T＞C家系和1個對照攜帶m.593T＞C家系，兩種突變的發(fā)生率差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。本研究選取4個家系（編號為：WZ133、WZ1224、WZ1225和WZ1260，見圖1）進行進一步分析。

2.2 臨床分析 WZ133來自湖北，先證者（III-6）現(xiàn)32歲，2004年12月發(fā)病，無誘發(fā)因素，無既往病史，無吸煙飲酒史，雙眼同時視力無痛性漸進性下降，視力檢查右眼：0.02，左眼：0.05，經(jīng)治療視力無明顯改善。次年4月到北京某醫(yī)院眼科就診，視力：右眼：0.05，左眼：0.04；眼底：雙視乳頭界清，顳側色淡，右黃斑區(qū)反光強，中心凹反光隱見，左黃斑中心光反射消失；雙眼瞳孔對光反射遲鈍等，表現(xiàn)為典型的LHON臨床特征。家系中的II-2和II-7發(fā)病，補充眼科檢查，但其他母系成員視力正常，也無其他疾病，外顯率為42.9%。WZ1224來自河北，先證者（II-9）現(xiàn)47歲，23歲時無明顯誘因視力下降，眼底檢查示視盤蒼白等。家系中其他7位母系成員無視力障礙，也無其他疾病，外顯率為12.5%。WZ1225來自河北，先證者（III-6）現(xiàn)18歲，10歲發(fā)現(xiàn)左眼視物不見，于同年12月于河北省某醫(yī)院就診，眼底檢查示視盤蒼白等，具有典型的LHON臨床表現(xiàn)。家系中其他7位母系成員視力均無異常，也無其他疾患，外顯率為12.5%。WZ1260來自浙江，先證者（III-1）現(xiàn)16歲，9歲時因雙眼先后視力驟降就診，診斷為LHON。家系中其他17位母系成員均無視力障礙及其他疾病，外顯率為5.6%。見表1-2。

圖1 4個LHON家系圖

表1 4個家系先證者及其他患者臨床資料總結

表2 4個家系臨床資料總結

2.3 線粒體基因組分析 測序結果經(jīng)DNASTAR等軟件并與修正的rCRS進行比對分析后，發(fā)現(xiàn)4個先證者的mtDNA序列上攜帶多個變異位點（見表3），包括：D-loop區(qū)有26個；MT-RNR1有4個；MT-RNR2有2個；蛋白質編碼區(qū)有41個同義突變，18個錯義突變。其中，4個先證者同時攜帶m.593T＞C同質性突變（WZ133-III-6同時攜帶了m.14484T＞C同質性突變，見圖2）和其他11個相同的突變。通過對人、大猩猩、小鼠、狗、牛、馬、藍鯨和非洲爪蟾這8種具有代表性的脊椎動物的mtDNA種系發(fā)生學進行分析，我們發(fā)現(xiàn)有28個變異位點在進化上保守。除了MTTF593T＞C和MT-ND614484T＞C外，未發(fā)現(xiàn)LHON相關的其他突變（http：//www.mitomap.org）。

2.4 線粒體單體型分析 與核基因組相比，線粒體基因組更容易積累突變，這主要是由于線粒體基因缺乏組蛋白的保護，其自身不但不存在有效的修復機制，還處于高復制率狀態(tài)，這樣增加了出錯的可能性，更重要的是mtDNA分子與呼吸鏈復合物緊密接觸，它們暴露在高超氧化物的環(huán)境中，更容易受損[2]。由于線粒體DNA屬于母系遺傳，線粒體DNA突變沿著放射的母系遺傳積累。當線粒體DNA在特定環(huán)境中獲得有益的功能突變時，這種線粒體DNA得到選擇性的富集，并在這樣的環(huán)境中形成了一組線粒體DNA單體型相關群體，被稱為線粒體單體型[14]。在美洲土著居民首次發(fā)現(xiàn)的mtDNA單體型被命名為A、B、C和D[15]。本研究的4個家系的先證者分別屬于C7a、M7c1b2b、H2a2和D4b2b2單體型，其單體型樹見圖3。

表3 4個先證者線粒體DNA全序列突變位點分析

續(xù)表3-1

續(xù)表3-2

圖2 4個LHON家系先證者及正常對照者tRNAPhe的部分測序峰圖

圖3 4個LHON家系先證者mtDNA序列的單倍型樹（包含修改后的rCRS）

2.5 線粒體tRNA二級結構分析 自由能的大小是衡量RNA結構在體內(nèi)是否穩(wěn)定存在的一個指標。近幾十年來，自由能最小化是RNA二級結構與預測中最常用的方法，利用熱力學原理，僅需原始序列（在沒有三級結構或蛋白質相互作用信息的情況下）即可準確預測RNA二級結構[12，16]。自由能越低，結構就越穩(wěn)定[17]。在m.593T＞C存在的情況下，線粒體tRNAPhe的二級結構發(fā)生改變（見圖4）。野生型線粒體tRNAPhe二級結構預測的自由能（ΔG）為-9.5，而存在m.593T＞C突變的tRNA的二級結構預測的自由能（ΔG）為-6.5。m.593T＞C突變使得線粒體tRNAPhe的二級結構發(fā)生改變，自由能增加，影響了tRNAPhe結構的穩(wěn)定性。

圖4 野生型線粒體tRNAPhe和tRNAPhe593T＞C二級結構預測圖

3 討論

本研究對4個中國漢族LHON家系的臨床、遺傳和分子生物學特征進行研究。從臨床角度來看，雖然這4 個家系先證者和部分母系成員具有典型的LHON臨床特征即雙眼同時或先后出現(xiàn)急性或亞急性無痛性視力損傷，而且還與LHON的男性好發(fā)這個臨床特征很吻合，但是他們的發(fā)病年齡、病情嚴重程度以及外顯率均有差異。4個家系的發(fā)病年齡為9～23歲，平均16歲，與張永梅等[9]報道的攜帶tRNAGlu14693A＞G的3個中國LHON家系（平均發(fā)病年齡為9歲）和LIANG等[18]報道的攜帶ND13394T＞C的4個中國LHON家系（10歲）的平均年齡相比要大一些。但是，比孫艷紅等[19]報道的僅攜帶14484原發(fā)突變位點（19.48歲）的3個中國LHON家系和QU等[20-21]報道的僅攜帶m.11778G＞A突變（30.5歲）的9個中國漢族LHON家系的平均發(fā)病年齡要小。4個家系患者的視力損傷程度從輕度到重度不等，WZ133-III-6和WZ133-II-2均屬重度。4個家系的外顯率也有差異，分別為42.9%、12.5%、12.5%和5.6%，其中WZ133家系的外顯率明顯高于其他家系。

在線粒體基因組分析中發(fā)現(xiàn)，4 個先證者同時攜帶MT-TF593T＞C同質性突變，其中WZ133家系的先證者也攜帶了m.14484T＞C突變。m.14484T＞C突變是3個原發(fā)性突變之一，同m.3460G＞A突變一樣，也是比較罕見的[2]。孟祥娟等[22]報道的中國人群攜帶m.14484T＞C突變的LHON線粒體單體型及多態(tài)位點分析中，攜帶m.14484T＞C突變的51例家系LHON平均外顯率為21.5%，經(jīng)線粒體基因組和單體型分析后發(fā)現(xiàn)線粒體單體型M10a可能增加視力損傷的風險。仲俊維等[1]報道的LHON外顯率的影響因素研究進展中指出：m.14484T＞C突變主要與單倍群J1相關。而本研究中，同時攜帶線粒體tRNAPhe593T＞C突變和m.14484T＞C突變家系的LHON外顯率近乎是此報道中平均外顯率的2倍，并且此先證者單體型分別為C7a，并不屬于LHON高發(fā)單體型；這就意味著，單體型可能不是影響外顯率的主要因素。那么此家系有可能是由于合并了線粒體其他突變而對外顯率和表型產(chǎn)生了影響。

在本研究中，4個先證者共同攜帶一個致病性突變（tRNAPhe593T＞C），且與非綜合征型耳聾相關[23]，但這4個先證者除了有LHON的癥狀以外，均無其他疾病。有報道，線粒體tRNAPhe593T＞C突變可能增強攜帶m.11778G＞A突變的中國LHON家系的外顯率[12]。那么同時攜帶tRNAPhe593T＞C突變和m.14484T＞C原發(fā)性突變的WZ133家系具有如此高的外顯率，可能是由于tRNAPhe593T＞C突變的協(xié)同作用。在本研究中，線粒體tRNAPhe593T＞C突變雖然在進化上不保守，但是經(jīng)RNAPhe二級結構預測發(fā)現(xiàn)：與野生型線粒體tRNAPhe相比，存在m.593T＞C突變的tRNA二級結構發(fā)生改變，且自由能增加，影響了tRNAPhe結構的穩(wěn)定性。tRNAPhe結構受到影響，就會導致其功能紊亂，影響翻譯甚至影響基因的表達。那么同時攜帶tRNAPhe593T＞C突變和m.14484T＞C原發(fā)性突變的WZ133家系具有如此高的LHON外顯率，可能是由于二者的協(xié)同作用。

綜上所述，m.593T＞C突變的存在增加了m.14484T＞C家系LHON的外顯率。盡管m.593T＞C位點在人類線粒體DNA中不具有進化保守性，突變率也不高，但經(jīng)tRNA二級結構預測發(fā)現(xiàn)，該突變的存在改變了tRNAPhe的二級結構，也影響了結構的穩(wěn)定性。這些證據(jù)表明，在LHON的外顯率上，m.593T＞C和m.14484T＞C突變可能會有協(xié)同作用。需要更多的研究來驗證我們目前的發(fā)現(xiàn)，并揭示線粒體tRNAPhe基因變異對m.14484T＞C致病性的影響。